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正文內(nèi)容

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2024-12-12 01:55 本頁面
 

【文章內(nèi)容簡介】 探測器(電壓)。若必要,將這群細(xì)胞調(diào)在所有圖的左下角。 用于同型對照的抗體為小鼠 抗鑰 孔嘁血藍(lán)素( KLH)。當(dāng)用于測定人的細(xì)胞時,所發(fā)生的結(jié)合是非特異結(jié)合。 抗體的這種非特異結(jié)合現(xiàn)象是由于抗體的 Fc端與細(xì)胞膜上的 Fc受體結(jié)合。這和自發(fā)熒光 都是背景熒光。特定抗體 Fab端與細(xì)胞表面上特定抗原的特異結(jié)合所發(fā)的熒光為陽性熒光。 若必要,用同型對照管,在所有 熒光點圖上調(diào)節(jié) FL1/2/3的電壓來調(diào)節(jié)背景熒光。 1.選擇點圖 2.在出現(xiàn)的對話框內(nèi)選擇 X軸: FL1, Y軸: FL2 3.選擇 G1=R1 4.點擊 OK, FL1/FL2的點圖出現(xiàn) 5. 點擊 FL1/FL2點圖的邊框并將之拖至 FSC/SSC圖的右側(cè) 6.同樣建立一個 FL3/FL2的點圖,并選擇 G1=R1。如獲取 4色樣本,進(jìn)行下一步。如獲 取 3色樣本,跳至第 8步。 7.同樣建立一個 FL3/FL4的點圖,并選擇 G1=R1。若無 FL4參數(shù),請確認(rèn)Detector/Amps 窗口中 Four color 前是否選中。 8.在工具板中選擇象限標(biāo)尺 ,在 FL1/FL2點圖上 以同型對照管的門內(nèi)細(xì)胞畫象限 , 這些象限指定了陰性 /陽性區(qū)域。 9.點擊 FL1/FL2點圖,拖動 Marker的柄將 它設(shè)定在 101處。 10.從 Status窗口選擇 Quadrant Stas(象限統(tǒng)計)。 11.在其余的圖上,重復(fù) 810步。 12.插上同型對照管 13.點擊 Aqusition Control窗口中的 Restart。 14.若必要,調(diào)節(jié) FL FL2的電壓(在 Detector/Amps 窗口中),使這群細(xì)胞調(diào)在所有圖的左下角。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 13 15.若必要,調(diào)節(jié) FL3的電壓(在 Detector/Amps 窗口中),使這群細(xì)胞調(diào)在所有圖的左下角。 注意:勿調(diào)節(jié) FL4的 PMT電壓,其電壓值有 FACSComp設(shè)定。 16.點擊 Aqusition Control窗口中的 Pause。 17.移去同型對照管。 18. 關(guān)閉 Detector/Amps 和 Threshold窗口 5. 6. 7 調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償 優(yōu)化的最后一步是調(diào)節(jié)光譜重疊。若 3色樣本,必要時需調(diào)節(jié) FL2%FL1, FL1%FL2,F(xiàn)L3%FL2, FL2%FL3的補(bǔ)償。若 4色樣本,必要時需也要調(diào)節(jié) FL3%FL4, FL4%FL3 。 選擇適當(dāng)?shù)脑噭┯脕碚{(diào)節(jié)補(bǔ)償很重要。 每種熒光素的補(bǔ)償應(yīng)用染色最強(qiáng)的細(xì)胞群來 設(shè)置。如一個 Panel中有: CD3FITC、CD4FITC、 CD8FITC,則 FITC的補(bǔ)償應(yīng)用 CD8FITC來設(shè)置。 補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)依賴于由同型對照管設(shè)定的探測器電壓。一旦電壓設(shè)定,補(bǔ)償用單陽性管調(diào)節(jié)。 1.從 Cytometer 菜單中選擇 Compensation 2.插上 CD3FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠 IgG1APC管。 3.點擊 Aqusition Control窗口中的 Restart。 4.若必要,調(diào) 節(jié) FL2%FL1使 FITC+細(xì)胞在 FL1/FL2點圖的右下象限。 5.移去此管,插上小鼠 IgG1FITC/CD8PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠 IgG1APC管。 6.點擊 Aqusition Control窗口中的 Pause、 Restart。 7.若必要,調(diào)節(jié) FL1%FL2使 PE+細(xì)胞在 FL1/FL2點圖的左上象限。 8.若必要,調(diào)節(jié) FL3%FL2使 PE+細(xì)胞在 FL3/FL2點圖的左上象限 9.移去此管,插上小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP/小鼠 IgG1APC管。 10.查看 FL2%FL3的補(bǔ)償,應(yīng)為 %,若必要,調(diào)節(jié)該補(bǔ)償。若作 3色,跳至 14 步。 11.查看 FL4%FL3的補(bǔ)償,應(yīng)為 %,若必要,調(diào)節(jié)該補(bǔ)償。 12.移去此管,插上小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/CD4 APC管。 13.查看 FL3%FL4的補(bǔ)償,應(yīng)為 %,若必要,調(diào)節(jié)該補(bǔ)償。 14.關(guān)閉 Compensation窗口。 15.點擊 Aqusition Control窗口中的 Pause、 Abort。 16.移去樣本管,插 上雙蒸水管。 17.將儀器處于 Standby狀態(tài)。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 14 5. 7 實驗練習(xí): 3色 /4色預(yù)獲取 在此練習(xí)中,您將: ? 設(shè)定 Acquisition(獲?。┖? Storage(儲存)的條件。 ? 設(shè)定文件儲存參數(shù) ? 創(chuàng)建試劑組合 5. 7. 1 設(shè)置 Acquisition amp。 Storage 窗口 在此窗口可設(shè)定獲取和儲存的顆粒數(shù)及類型。也可設(shè)定儲存的參數(shù)及其分辨率。 1.從 Acquire 菜單中選擇 Acquisition amp。 Storage,出現(xiàn) Acquisition amp。 Storage窗口 2.在 Acquisition Gate 中選擇默認(rèn)設(shè)置: Accept 、 All 獲取的數(shù)據(jù)首先由獲取的門處理,落在門內(nèi)的所有顆粒被接受或放棄。然后數(shù)據(jù)按 Collection Criteria 窗口中的設(shè)置處理。 3.在 Collection Criteria中選擇默認(rèn)設(shè)置: Event Count, 10000, All 可設(shè)置獲取終止的條件: Event Count:獲取的顆粒數(shù) Time:獲取時間 4.在 Storage Gate中選擇默認(rèn)設(shè)置: All 5.在 Resolution (分辨率)中選擇默認(rèn)設(shè)置: 1024 6.點擊 Parameter Saved,出現(xiàn)對話框 7.若無第二根激光器,不選 P6( FLXA)、 P7( FLXW)。只有被選參數(shù)才儲存在 Data file中。若 3 色分析, FSCH、 SSCH、 FL1H、 FL2H、 FL3H需儲存。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 15 8.點擊此對話框的 OK 9.點擊 Acquisition amp。 Storage窗口的 OK 5. 7. 2 設(shè)置 Parameter Description 1. 從 Acquire 菜單中選擇 Parameter Description,出現(xiàn) Parameter Description對話框。 2.點擊 Folder,出現(xiàn)對話框,選擇或創(chuàng)建文件夾。 3.點擊此對話框的 Select “ ”。 4.點擊 Parameter Description對話框的 File ,出現(xiàn)文件名編輯窗口。 5.在 Custom Prefix中:輸入文件名 6.在 File Name Suffix中選擇 File Count 7.在 File Count 中:確認(rèn)輸入的為 1 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 16 8.點擊此對話框的 OK 9.在 Parameter Description對話框中輸入您想保存的 Patient ID, Sample ID, Comments等信息。 10.選擇 或 輸入 所有參數(shù)名 選擇:點擊右側(cè)的箭頭,選擇已設(shè)定的參數(shù)名。 輸入:在 P1后的空格中輸入?yún)?shù)名。 11.將 Parameter Description對話框拖至適當(dāng)位置以不妨礙視野,勿關(guān)閉。 5. 7. 3 編輯 Reagent Panel 編輯 Panel允許您 將所定義的試劑進(jìn)行組合,以便為實驗的每管自動選擇參數(shù)名。可編輯 3色或 4色的 Panel。 3色 Panel: 小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP CD3FITC/CD16+56PE/CD45PerCP 4色 Panel: 小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP/小鼠 IgG1APC CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP/CD4APC CD3FITC/ CD16+56PE/CD45PerCP/CD19APC 1. 從 Acquire 菜單中選擇 Edit Panel,出現(xiàn) Edit Panel對話框 2.點擊 Panel 上的 Add, new panel 就出現(xiàn)在 Panel list 中,輸入 panel 名 3.選擇該 panel(變黑),點擊 Tube 上的 Add, Tube1就出現(xiàn)在 tube list 中,輸入 tube 名 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 17 4.選擇該 tube(變黑),在 label lis
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