【文章內(nèi)容簡介】 探測器（電壓）。若必要，將這群細(xì)胞調(diào)在所有圖的左下角。 用于同型對照的抗體為小鼠 抗鑰 孔嘁血藍(lán)素（ KLH）。當(dāng)用于測定人的細(xì)胞時，所發(fā)生的結(jié)合是非特異結(jié)合。 抗體的這種非特異結(jié)合現(xiàn)象是由于抗體的 Fc端與細(xì)胞膜上的 Fc受體結(jié)合。這和自發(fā)熒光 都是背景熒光。特定抗體 Fab端與細(xì)胞表面上特定抗原的特異結(jié)合所發(fā)的熒光為陽性熒光。 若必要，用同型對照管，在所有 熒光點圖上調(diào)節(jié) FL1/2/3的電壓來調(diào)節(jié)背景熒光。 1．選擇點圖 2．在出現(xiàn)的對話框內(nèi)選擇 X軸： FL1， Y軸： FL2 3．選擇 G1=R1 4．點擊 OK， FL1/FL2的點圖出現(xiàn) 5． 點擊 FL1/FL2點圖的邊框并將之拖至 FSC/SSC圖的右側(cè) 6．同樣建立一個 FL3/FL2的點圖，并選擇 G1=R1。如獲取 4色樣本，進(jìn)行下一步。如獲 取 3色樣本，跳至第 8步。 7．同樣建立一個 FL3/FL4的點圖，并選擇 G1=R1。若無 FL4參數(shù)，請確認(rèn)Detector/Amps 窗口中 Four color 前是否選中。 8．在工具板中選擇象限標(biāo)尺 ,在 FL1/FL2點圖上 以同型對照管的門內(nèi)細(xì)胞畫象限 , 這些象限指定了陰性 /陽性區(qū)域。 9．點擊 FL1/FL2點圖，拖動 Marker的柄將 它設(shè)定在 101處。 10．從 Status窗口選擇 Quadrant Stas（象限統(tǒng)計）。 11．在其余的圖上，重復(fù) 810步。 12．插上同型對照管 13．點擊 Aqusition Control窗口中的 Restart。 14．若必要，調(diào)節(jié) FL FL2的電壓（在 Detector/Amps 窗口中），使這群細(xì)胞調(diào)在所有圖的左下角。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 13 15．若必要，調(diào)節(jié) FL3的電壓（在 Detector/Amps 窗口中），使這群細(xì)胞調(diào)在所有圖的左下角。 注意：勿調(diào)節(jié) FL4的 PMT電壓，其電壓值有 FACSComp設(shè)定。 16．點擊 Aqusition Control窗口中的 Pause。 17．移去同型對照管。 18． 關(guān)閉 Detector/Amps 和 Threshold窗口 5． 6． 7 調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償 優(yōu)化的最后一步是調(diào)節(jié)光譜重疊。若 3色樣本，必要時需調(diào)節(jié) FL2%FL1， FL1%FL2，F(xiàn)L3%FL2， FL2%FL3的補(bǔ)償。若 4色樣本，必要時需也要調(diào)節(jié) FL3%FL4， FL4%FL3 。 選擇適當(dāng)?shù)脑噭┯脕碚{(diào)節(jié)補(bǔ)償很重要。 每種熒光素的補(bǔ)償應(yīng)用染色最強(qiáng)的細(xì)胞群來 設(shè)置。如一個 Panel中有： CD3FITC、CD4FITC、 CD8FITC，則 FITC的補(bǔ)償應(yīng)用 CD8FITC來設(shè)置。 補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)依賴于由同型對照管設(shè)定的探測器電壓。一旦電壓設(shè)定，補(bǔ)償用單陽性管調(diào)節(jié)。 1．從 Cytometer 菜單中選擇 Compensation 2．插上 CD3FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠 IgG1APC管。 3．點擊 Aqusition Control窗口中的 Restart。 4．若必要，調(diào) 節(jié) FL2%FL1使 FITC+細(xì)胞在 FL1/FL2點圖的右下象限。 5．移去此管，插上小鼠 IgG1FITC/CD8PE/小鼠 IgG1PerCP/小鼠 IgG1APC管。 6．點擊 Aqusition Control窗口中的 Pause、 Restart。 7．若必要，調(diào)節(jié) FL1%FL2使 PE+細(xì)胞在 FL1/FL2點圖的左上象限。 8．若必要，調(diào)節(jié) FL3%FL2使 PE+細(xì)胞在 FL3/FL2點圖的左上象限 9．移去此管，插上小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP/小鼠 IgG1APC管。 10．查看 FL2%FL3的補(bǔ)償，應(yīng)為 %,若必要，調(diào)節(jié)該補(bǔ)償。若作 3色，跳至 14 步。 11．查看 FL4%FL3的補(bǔ)償，應(yīng)為 %,若必要，調(diào)節(jié)該補(bǔ)償。 12．移去此管，插上小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/小鼠 IgG1PerCP/CD4 APC管。 13．查看 FL3%FL4的補(bǔ)償，應(yīng)為 %,若必要，調(diào)節(jié)該補(bǔ)償。 14．關(guān)閉 Compensation窗口。 15．點擊 Aqusition Control窗口中的 Pause、 Abort。 16．移去樣本管，插 上雙蒸水管。 17．將儀器處于 Standby狀態(tài)。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 14 5． 7 實驗練習(xí)： 3色 /4色預(yù)獲取 在此練習(xí)中，您將： ? 設(shè)定 Acquisition（獲?。┖? Storage（儲存）的條件。 ? 設(shè)定文件儲存參數(shù) ? 創(chuàng)建試劑組合 5． 7． 1 設(shè)置 Acquisition amp。 Storage 窗口 在此窗口可設(shè)定獲取和儲存的顆粒數(shù)及類型。也可設(shè)定儲存的參數(shù)及其分辨率。 1．從 Acquire 菜單中選擇 Acquisition amp。 Storage，出現(xiàn) Acquisition amp。 Storage窗口 2．在 Acquisition Gate 中選擇默認(rèn)設(shè)置： Accept 、 All 獲取的數(shù)據(jù)首先由獲取的門處理，落在門內(nèi)的所有顆粒被接受或放棄。然后數(shù)據(jù)按 Collection Criteria 窗口中的設(shè)置處理。 3．在 Collection Criteria中選擇默認(rèn)設(shè)置： Event Count， 10000， All 可設(shè)置獲取終止的條件： Event Count：獲取的顆粒數(shù) Time：獲取時間 4．在 Storage Gate中選擇默認(rèn)設(shè)置： All 5．在 Resolution （分辨率）中選擇默認(rèn)設(shè)置： 1024 6．點擊 Parameter Saved，出現(xiàn)對話框 7．若無第二根激光器，不選 P6（ FLXA）、 P7（ FLXW）。只有被選參數(shù)才儲存在 Data file中。若 3 色分析， FSCH、 SSCH、 FL1H、 FL2H、 FL3H需儲存。 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 15 8．點擊此對話框的 OK 9．點擊 Acquisition amp。 Storage窗口的 OK 5． 7． 2 設(shè)置 Parameter Description 1． 從 Acquire 菜單中選擇 Parameter Description，出現(xiàn) Parameter Description對話框。 2．點擊 Folder，出現(xiàn)對話框，選擇或創(chuàng)建文件夾。 3．點擊此對話框的 Select “ ”。 4．點擊 Parameter Description對話框的 File ，出現(xiàn)文件名編輯窗口。 5．在 Custom Prefix中：輸入文件名 6．在 File Name Suffix中選擇 File Count 7．在 File Count 中：確認(rèn)輸入的為 1 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 16 8．點擊此對話框的 OK 9．在 Parameter Description對話框中輸入您想保存的 Patient ID， Sample ID， Comments等信息。 10．選擇 或 輸入 所有參數(shù)名 選擇：點擊右側(cè)的箭頭，選擇已設(shè)定的參數(shù)名。 輸入：在 P1后的空格中輸入?yún)?shù)名。 11．將 Parameter Description對話框拖至適當(dāng)位置以不妨礙視野，勿關(guān)閉。 5． 7． 3 編輯 Reagent Panel 編輯 Panel允許您 將所定義的試劑進(jìn)行組合，以便為實驗的每管自動選擇參數(shù)名。可編輯 3色或 4色的 Panel。 3色 Panel： 小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP CD3FITC/CD16+56PE/CD45PerCP 4色 Panel： 小鼠 IgG1FITC/小鼠 IgG1PE/CD45PerCP/小鼠 IgG1APC CD3FITC/CD8PE/CD45PerCP/CD4APC CD3FITC/ CD16+56PE/CD45PerCP/CD19APC 1． 從 Acquire 菜單中選擇 Edit Panel，出現(xiàn) Edit Panel對話框 2．點擊 Panel 上的 Add， new panel 就出現(xiàn)在 Panel list 中，輸入 panel 名 3．選擇該 panel（變黑），點擊 Tube 上的 Add， Tube1就出現(xiàn)在 tube list 中，輸入 tube 名 BD FACSCalibur 中文培訓(xùn)手冊 3585898611dcd89f17284c7e79f1eb6e Page 5 17 4．選擇該 tube（變黑），在 label lis