【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 75℃ ④ DNA 片斷的連接重組，采用 DNA片段的連接酶有 DNA 、 T4DNA 連接酶 （ 4） cDNA 文庫(kù) ① cDNA（ plementary DNA)文庫(kù)概念 cDNA（ plementary DNA) 指由 mRNA 通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄而成。 cDNA（ plementary DNA)文庫(kù)：某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的全部 mRNA 經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種 cDNA 片段分別與克隆載體重組，儲(chǔ)存在一種受體菌 克隆子群體中，這樣的群體稱(chēng)為 cDNA 文庫(kù)。 ②基本過(guò)程 cDNA 克隆基本過(guò)程的是通過(guò)一系列的酶催作用，使總 mRNA 轉(zhuǎn)變成雙鏈 cDNA群體，并插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，然后再轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主菌株的細(xì)胞內(nèi)，以構(gòu)成了包含產(chǎn)所有基因編碼的 cDNA 基因文庫(kù)（ cDNA library) 。 ③ cDNA 克隆的優(yōu)越性 （ 5）基因組克隆 ①含義 ：基因組文庫(kù)（ gene library(bank),genomic library)是指將真核生物的染色體組或原核生物的基因組切成許多片段，分別連接到載體（噬菌體 或粘粒）上，經(jīng)體外包裝，侵染大腸桿菌后形成的克隆群體。它包含某一生物的全部或大部分染色體組，其中的每一克隆僅含有某一生物基因組的一個(gè)片段。當(dāng)需要這一生物的某一基因時(shí)通過(guò)特定片段找到理想基因所在的克隆。 ② 基本步驟： DNA 產(chǎn)生適當(dāng)大小的 DNA片段 DNA 片段同適當(dāng)?shù)摩耸删w連接成重組分子 。 受體細(xì)胞 所謂基因克隆的受體細(xì)胞，從實(shí)驗(yàn)技術(shù)上講是能攝取外源 DNA（基因）并使其穩(wěn)定維持的細(xì) 胞；從實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳现v是有應(yīng)用價(jià)值和理論研究?jī)r(jià)值的細(xì)胞。原核生物細(xì)胞、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞可以作為受體細(xì)胞，但不是所有細(xì)胞都可以作為受體細(xì)胞。 目前用作基因克隆受體的主要是大腸桿菌，酵母和某些動(dòng)植物的細(xì)胞。 提問(wèn)：為什么目前用作基因克隆受體的主要是大腸桿菌？ （二）基因工程的基本操作過(guò)程 多媒體 演示操作過(guò)程 第一步：目的基因的制取 目前獲取目的基因的方法主要有三種：反向轉(zhuǎn)錄法、內(nèi)切酶切割分離法和人工合成法 . 第二步：基因載體的選取 : 用人工方法，取得目的基因的適宜的載體，即質(zhì)粒（一種環(huán)狀雙鏈 DNA）或 病毒。載體一般帶有必要的標(biāo)志基因，以便進(jìn)行檢測(cè)。 復(fù)習(xí)提問(wèn)：基因克隆載體必須具備三個(gè)條件： 第三步： DNA 的體外重組 : 第四步： DNA 重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞 : 目前用于重組 DNA 分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法很多，具體采用那一種方法，應(yīng)根據(jù)選用的載體系統(tǒng)和受體細(xì)胞類(lèi)型而定。 外源 DNA 轉(zhuǎn)化法： 病毒（噬菌體）顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)法： 第五步：受體細(xì)胞的繁殖擴(kuò)增 : 含重組 DNA 的活受體細(xì)胞，再在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下，進(jìn)行繁殖和擴(kuò)增，使得重組 DNA 分子在受體細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)大量增加。 第六步：克隆子的篩選和鑒定 : 基本概念： ? 克隆子：通常將攝取外源 DNA 分子并能使該分子在其中穩(wěn)定維持的受體細(xì)胞統(tǒng)稱(chēng) 克隆子。也叫轉(zhuǎn)化子。 ? 重組子：含重組 DNA 分子的 克隆子稱(chēng)重組子。 克隆子的篩選方法 1）根據(jù)載體選擇的標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)化子 ? 抗藥性標(biāo)記插入失活選擇法 ? 根據(jù)載體除草劑抗性基因 ? β 半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法 ? 根據(jù)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑非依賴型篩選轉(zhuǎn)化子 ? 根據(jù)核苷酸合成代謝相關(guān)酶基因的缺失互補(bǔ)篩選 2）根據(jù)報(bào)告基因篩選轉(zhuǎn)化子 一個(gè)編碼可被檢測(cè)的蛋白質(zhì)或酶的基因，即表達(dá)產(chǎn)物易被鑒定的基因。 3）根據(jù)形成噬菌斑篩選轉(zhuǎn)化子 重組子的鑒 定 通過(guò)篩選獲得轉(zhuǎn)化子，那么轉(zhuǎn)化子是否是我們需要的重組子呢？就需要進(jìn)一步的分析鑒定重組子基因組中外源 DNA 片段、目的基因轉(zhuǎn)錄的 mRNA或翻譯的多肽（蛋白質(zhì)、酶） 1）據(jù)重組 DNA 分子特征鑒定重組子 ? 根據(jù)重組 DNA分子大小鑒定重組子 初步鑒定 ? 據(jù)酶切圖譜鑒定重組子 ? PCR 擴(kuò)增 ? DNA 雜交法鑒定 ? 應(yīng)用 DNA 芯片鑒定重組子 ? 據(jù)核苷酸序列鑒定重組子 2）據(jù)目的基因轉(zhuǎn)錄的 mRNA 鑒定重組子 ? Northern 雜交 3） 據(jù)翻譯產(chǎn)物鑒定重組子 ? 電泳 ? 免疫檢測(cè)法 第七步：目的基因的表達(dá)。 （三）基因工程應(yīng)用 研究 基因工程技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和農(nóng)、牧、漁等產(chǎn)業(yè)，甚至與環(huán)境保護(hù)有密切關(guān)系，將在下面有關(guān)章節(jié)論述。這里僅就基因工程應(yīng)用研究進(jìn)展作簡(jiǎn)單介紹。 基困工程藥物研究 基因治療研究 轉(zhuǎn)基因植物研究 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究 環(huán)境保護(hù)研究 基因工程的安全性研究 三、實(shí)驗(yàn)：辯論課（ 4學(xué)時(shí)） （一）組織教學(xué)并提出本次辯論課的要求與安排 辯論題目：基因工程是生物技術(shù)的核心技術(shù) 要求與安排：將全班同學(xué)按正、反分為為 2組，每組選 1 名同學(xué)作為主陳述，其他同學(xué)作為副陳述可以隨時(shí)補(bǔ)充觀點(diǎn)；每組 通過(guò)查資料提出一個(gè)觀點(diǎn)，組與組之間以不同觀點(diǎn)進(jìn)行討論和交流。教師作為主持人隨時(shí)調(diào)節(jié)氣氛和引導(dǎo)學(xué)生。學(xué)生可以借助多媒體進(jìn)行。 （二）辯論開(kāi)始： 每組觀點(diǎn)表述 就不同的觀點(diǎn)，以自由發(fā)言的方式，組與組之間進(jìn)行討論和交流 在此過(guò)程中教師要觀察學(xué)生的表現(xiàn)，并隨時(shí)引導(dǎo)學(xué)生。還要隨時(shí)調(diào)節(jié)氣氛使多位學(xué)生積極參與，辯論氣氛熱烈。 （三）教師總結(jié)： 三、課程小結(jié) 基因工程以 DNA 為基本材料。 基因工程的四大要素是 基因工程工具酶、載體、目的基因、受體細(xì)胞。 基因工程操作流程包括目的基因的分離，與克隆載體重組 ，轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，篩選和鑒定克隆子。 四、思考題 簡(jiǎn)述 限制性核酸內(nèi)切酶和 DNA 核酸酶的作用？ 什么細(xì)胞能作為受體細(xì)胞？ 基因工程的操作流程？ 基因工程的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值？ 五、本章參考書(shū)： 1.《作物育種生物技術(shù)》 .陳佩度主編 .—— 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2.《現(xiàn)代生命科學(xué)概論》 .黃詩(shī)箋主編 .—— 北京：高等教育出版社， 3.《現(xiàn)代生物技術(shù)導(dǎo)論》 .陳章良主編 .—— 北京：高等教育出版社， 1998 4.《現(xiàn)代生物技術(shù)導(dǎo)論》，瞿禮嘉，顧紅雅，胡蘋(píng)，陳章良編著，高等教育出版社， 1998 5.《現(xiàn)代應(yīng)用生物技術(shù)》 .劉仲敏、林興兵、楊生玉主編 .化學(xué)工業(yè)出版社， 1992 6.《現(xiàn)代生物技術(shù)導(dǎo)論》 .瞿禮佳、顧紅雅等主編 .高等教育出版社， 1998 7.《基因工程原理》 .吳乃虎主編 .科學(xué)出版社， 1999 8.《現(xiàn)代生物技術(shù)概論》 .何效忠等編著 .北京師范大學(xué)出版社， 1999 9.《生物工程概論》 .王聯(lián)結(jié)主編 .中國(guó)輕工業(yè)出版社 .2020 10.《生物技術(shù)》 .朱圣庚等主編 .上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 1995 11.《生物技術(shù)的現(xiàn)狀與未來(lái)》 .顧方舟、盧圣棟主編 .北京醫(yī)科大學(xué)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版， 1990 12.《現(xiàn)代生物學(xué)導(dǎo)論》 .壽天德主編 .中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)出版社， 2020 13.《植物生物技術(shù)》 .張獻(xiàn)龍主編 .農(nóng)業(yè)出版社 .2020 14.《基因工程》 .樓士林、楊盛昌等主編 .科學(xué)出版社， 2020 15.《現(xiàn)代生物技術(shù)及其產(chǎn)業(yè) .羅明典主編 .復(fù)旦大學(xué)出版社， 2020 16.《植物生物技術(shù)》 .許智宏主編 .上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 1998 17.《基因組學(xué)與人類(lèi)健康》 .陳竺等編著 .科學(xué)出版社， 2020 第三章 細(xì)胞工程（ cell engineering）教案（ 1） 植物細(xì)胞工程 教學(xué)目的： 掌握細(xì)胞工程的概念及基本 操作技術(shù)； 了解植物細(xì)胞工程的研究進(jìn)展與應(yīng)用前景； 掌握植物組織培養(yǎng)的基本原理和方法；掌握植物細(xì)胞培養(yǎng)、人工種子、細(xì)胞融合的基本原理和方法；了解植物組織培養(yǎng)在社會(huì)經(jīng)濟(jì)生活中的應(yīng)用； 教學(xué)重點(diǎn)： 細(xì)胞工程的概念及基本操作技術(shù)； 植物組織培養(yǎng)的基本原理和方法；植物細(xì)胞培養(yǎng)、人工種子、細(xì)胞融合的基本原理和方法 教學(xué)難點(diǎn) ：植物組織培養(yǎng)的基本原理和方法；植物細(xì)胞培養(yǎng)、人工種子、細(xì)胞融合的基本原理和方法 ； 課 型： 理論課、實(shí)驗(yàn)課 教學(xué)方法 ：講授為主，借助多媒體課件及幻燈片穿插演示法、提問(wèn)法、討 論法和啟發(fā)式教學(xué) 教學(xué)用具： 多媒體課件、投影儀、黑板 教學(xué)時(shí)數(shù) ：理論教學(xué) 3學(xué)時(shí)，實(shí)驗(yàn)課 8學(xué)時(shí) 教學(xué)內(nèi)容 ：本次課講授《生物技術(shù)概論》 3 細(xì)胞工程 （ P6091），包括 細(xì)胞工程的基礎(chǔ)知識(shí)與基本技術(shù)、植物細(xì)胞工程；其中重點(diǎn)講授：細(xì)胞工程的概念及基本操作技術(shù)；植物組織培養(yǎng)的基本原理和方法；植物細(xì)胞培養(yǎng)、人工種子。 教學(xué)過(guò)程及教學(xué)設(shè)計(jì)： 一、復(fù)習(xí)舊課 概述上次課主要內(nèi)容 提問(wèn)： 基因工程的操作流程？ 二、講授新課 觀看幻燈片“兩層摟”并植物導(dǎo)入新課 （一） 細(xì)胞工程概述 細(xì)胞 工程概念 細(xì)胞工程：在細(xì)胞水平上研究、開(kāi)發(fā)、利用各類(lèi)細(xì)胞的工程，即人們根據(jù)科學(xué)設(shè)計(jì)改變細(xì)胞的遺傳基礎(chǔ)，并通過(guò)無(wú)菌操作，大量培養(yǎng)細(xì)胞、組織乃至完整個(gè)體的技術(shù)（教材 P60）。 細(xì)胞工程研究的對(duì)象 細(xì)胞或其組成部分和構(gòu)成的組織、器官等如染色體、細(xì)胞核、原生質(zhì)體、整個(gè)細(xì)胞、受精卵、胚胎、組織或器官。 細(xì)胞工程研究主要內(nèi)容 1） 細(xì)胞與組織培養(yǎng)：細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)三層次 2） 細(xì)胞融合：?jiǎn)慰寺】贵w 3） 染色體工程：染色體的添加、消減、替換 4）胚胎工程：胚胎分割、胚胎融合、核移植、體外受精、性別鑒定、胚 胎冷凍 5）細(xì)胞遺傳工程：克隆、轉(zhuǎn)基因技術(shù) 細(xì)胞工程的基本操縱技術(shù) 1）無(wú)菌才操縱技術(shù) 2）細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 3）細(xì)胞融合技術(shù) 細(xì)胞工程的優(yōu)點(diǎn) 1） 細(xì)胞工程開(kāi)辟了基因重組的新途徑 2）細(xì)胞工程克服了常規(guī)雜交的局限性，使遠(yuǎn)緣雜交有了新的途徑。 3） 用細(xì)胞工程的技術(shù)來(lái)改造和創(chuàng)造新生物，比起用基因工程技術(shù)來(lái)稍為容易些。 6 、細(xì)胞工程與其他生物工程的關(guān)系 7 、細(xì)胞工程的應(yīng)用 細(xì)胞工程作為科學(xué)研究的一種手段，已經(jīng)滲入到生物工程的各個(gè)方面，成為必不可少的配套技術(shù)。在農(nóng)林、園藝和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中，細(xì)胞工程正在為 人類(lèi)做出巨大的貢獻(xiàn)。 1） 優(yōu)質(zhì)植物快速培育與繁殖 2） 動(dòng)物胚胎工程快速繁殖優(yōu)良、瀕危品種 3） 利用動(dòng)植物細(xì)胞培育生產(chǎn)活性產(chǎn)物、藥品 4） 新型動(dòng)植物品種的培育 5） 供醫(yī)學(xué)器官修復(fù)或移植的組織工程 6） 轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物的生物反應(yīng)器工程 7） 珍稀動(dòng)植物資源的保存與保護(hù) 8）在遺傳學(xué)等領(lǐng)域的理論研究 9） 在能源、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域的應(yīng)用 （二）植物細(xì)胞工程 植物組織培養(yǎng)（ Plant tissue culture） 1）幾個(gè)重要概念 ※ 植物組織培養(yǎng)： 在無(wú)菌條件下，將離體的植物器官（根尖、莖尖、葉、花、果實(shí)、 種子等）、組織（花藥、胚乳、皮層等）、細(xì)胞（體細(xì)胞、生殖細(xì)胞等）、胚胎（成熟或未成熟的胚）、原生質(zhì)體等培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予人工控制的培養(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織或叢生芽或長(zhǎng)成新的完整的植株的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。也叫“離體培養(yǎng)” （ Culture in vitro） 或“試管培養(yǎng)” （ In testtube culture） 。 ※ 植物細(xì)胞全能性（ Cell Totipotency）：指任何具有完整的細(xì)胞核的生活植物細(xì)胞，都攜帶一套完整的基因組，并具有發(fā)育成為完整植株的潛在能力。 ※ 外植體 (Explant)：植物組織培 養(yǎng)中用來(lái)進(jìn)行離體無(wú)菌培養(yǎng)的離體材料，可以是器官、組織、細(xì)胞和原生質(zhì)體等。 ※ 愈傷組織 (Callus)：外植體產(chǎn)生的一團(tuán)無(wú)序生長(zhǎng)的薄壁細(xì)胞。 ※ 脫分化（ dedifferentiation）：原來(lái)已經(jīng)分化 ,并且具有一定功能的體細(xì)胞 (或性細(xì)胞 )，喪失了原有的結(jié)構(gòu)和功能 ,又重新恢復(fù)了分裂功能 ,就叫做植物細(xì)胞的脫分化。 ※ 再分化（ redifferentiation）：已脫分化的細(xì)胞和組織再次分化發(fā)育成為完整植株。 ※ 形態(tài)發(fā)生（ morphologenesis）：指細(xì)胞再生植株的過(guò)程或個(gè)體發(fā)育中機(jī)體及其器官形態(tài)結(jié)構(gòu)的形成過(guò)程 。 2） 植物組織培養(yǎng)的程序 第一步：預(yù)備階段 （ 1）外植體的選擇：優(yōu)良種質(zhì)、健壯、適宜發(fā)育時(shí)期、適宜部位和大小 （ 3）培養(yǎng)基（ Culture medium）的配制 一個(gè)完善的培養(yǎng)基成分：無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分：大量元素（ 濃度大于 毫摩爾 /升）、 微量元素（ 其濃度小于 毫摩爾 /升）； 有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)（常稱(chēng)為激素） （ 2）外植體的表面消毒滅菌 材料→自來(lái)水沖洗→蒸餾水→ 75%酒精 30 S →無(wú)菌水 12 次→ 12%次氯酸鈉或次氯酸鈣飽和液消毒 1030min 或 %升汞（加吐溫） 510 min →無(wú)菌水洗 45次。 第二步 接種（接種室） 第三步 培養(yǎng)（ Culture）（培養(yǎng)室） （ 1）誘導(dǎo)去分化階段 即初代培養(yǎng)