【文章內(nèi)容簡介】 。 (3)在 DMEM 中加入 10％ FBS，10ng/mLTGFβ1 ， 25ng/mL bFGF， 107M地塞米松作為誘導培養(yǎng)基。采用普通誘導培養(yǎng)、密集誘導培養(yǎng)、結合生物反應器技術體外構建無支架軟骨組織。成軟骨細胞表型通過番紅 “O” 染色、甲苯胺蘭染色以及 Ⅱ 型膠原免疫組織化學染色進行鑒別。 GAGs 定量檢測應用二甲基亞甲蘭法， Ⅱ 型膠原定量檢測通過 ELISA 法。(4)分別對人臍帶 Wharton 膠 MSCs、向軟骨誘導培養(yǎng)后的 MSCs 以及人軟骨細胞進行細胞因子抗體芯片檢測，比較人臍帶 Wharton 膠 MSCs 軟骨誘導前后與正常人軟骨細胞細胞因子表達水平，為同種異體移植奠定實驗基礎 . 結果： (1)人臍帶組織富含膠原和 GAGs， HE染色發(fā)現(xiàn) Wharton 膠中含有大量的間質細胞； (2)采用酶消化法分離可以快速分離 Wharton 膠中間質細胞，并迅速貼壁生長；采用組織塊法培養(yǎng)原代培養(yǎng)時間較長。流式細 胞檢測表明這些細胞表達 CD4 CD10CD271 等 MSCs 標志物；不表達 CD3 CD45 等造血等標志物； HLAABC陽性表達，HLADPDQDR 陰性表達。經(jīng)過凍存復蘇后免疫表型無顯著變化。 (3)未進行軟骨誘導的細胞弱表達軟骨細胞標志，誘導后 GAGs 和 Ⅱ 型膠原定量檢測結果均顯著高于未誘導細胞。 RTPCR結果顯示人臍帶 Wharton膠 MSCs誘導前后均表達 SOX Wharton 膠 MSCs 經(jīng)密集誘導培養(yǎng)后迅速結成膜狀；采用密集誘導培養(yǎng)結合生物反應器培養(yǎng)體外可以構建大塊無支架 組織工程軟骨。 (4)采用細胞因子芯片技術對人臍帶 Wharton 膠 MSCs、誘導后的軟骨細胞以及正常軟骨細胞進行比較分析發(fā)現(xiàn)，臍帶 Wharton 膠干細胞以及誘導后的軟骨細胞在軟骨相關因子表達水平與軟骨細胞接近；同時還表達腫瘤抑制生長因子以及某些神經(jīng)生長因子。 結論： (1)人臍帶 Wharton 膠富含膠原和 GAGs，具有與軟骨組織相似的細胞外基質； (2)人臍帶 Wharton 膠中 MSCs 來源廣泛，無倫理學限制；臍帶Mscs 具有間質干細胞的特性，不向造血系分化； (3)臍帶 MSCs 具有前軟骨細胞的特性，有望作為軟骨 組織工程的新型的種子細胞。臍帶 MSCs 密集誘導培養(yǎng)結合旋轉式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)可體外構建大塊無支架組織工程軟骨組織，有望作為新型體外構建軟骨組織的方法。 (4)人臍帶 Wharton 膠 MSCs 以及誘導后的軟骨細胞具有與軟骨細胞相同的表達譜，表明其更為接近軟骨細胞，是較好的軟骨組織工程的種子細胞來源。 關節(jié)軟骨損傷是關節(jié)外科常見的疾病 .軟骨由于其自身的解剖特點，損傷后很難自愈，這也是導致關節(jié)疾病和關節(jié)不穩(wěn)的主要原因。目前，關節(jié)鏡下盥洗術、微骨折技術、馬賽克移植術等治療方法遠期效果均不滿意，最終導致關節(jié)軟骨的退變和骨性關 節(jié)炎。采用自體軟骨細胞移植 (Autologous chondrocyte implantation， ACI)能夠實現(xiàn)透明軟骨或透明樣軟骨修復，并取得較好的臨床療效。但 ACI 的缺點是供區(qū)出現(xiàn)新的缺損，需要二次手術，增加患者的痛苦。采用干細胞移植治療軟骨缺損是一個新興的治療手段，并認為間充質干細胞(Mesenchymal stem cells， MSCs)是最有希望的干細胞。 MSCs 是具有自我復制和多向分化潛能的一類多能干細胞。目前， MSCs 主要來源于骨髓，但獲得骨髓時造成患者的痛苦，且骨髓源性間充質干細胞 (Bone marrow stromal cells，BMSCs)隨著年齡增長其細胞數(shù)量和擴增、分化能力出現(xiàn)明顯下降趨勢，故尋找一種能替代 BMSCs，并可彌補其缺陷干細胞來源，已越來越受到各國學者的關注。胚胎干細胞 (Embryonic stem cells， ESCs)尚存在定向分化和純化的技術障礙，且面臨眾多倫理、法律方面的問題，也有移植后形成畸胎瘤的報道，應用受到一定限制。臍帶屬于胚胎外組織，是胎兒分娩后的廢棄物，組織來源廣泛，無倫理學限制。臍帶由臍帶外膜、臍動脈、臍靜脈以及血管周圍的黏蛋白樣組織，后者被稱為 Wharton 膠。 本研究目的為探討臍帶 Wharton 膠中干細胞作為軟骨組織工程種子細胞的可行性，并從四個方面進行闡述。第一部分為人臍帶 Wharton膠中的基質成分定性和定量分析的實驗研究；第二部分為人臍帶臍帶 Wharton膠中 MSCs 的分離、培養(yǎng)及生物學性狀的實驗研究；第三部分人臍帶 Wharton 膠中 MSCs 向軟骨誘導培養(yǎng)的實驗研究；第四部分為細胞因子在人臍帶 Wharton 膠間質干細胞及其誘導產(chǎn)生的軟骨細胞的表達 .本研究從組織學、細胞學和組織化學、基因水平和蛋白表達水平探討臍帶 Wharton 膠及 Wharton 膠中 MSCs 的生物學特性和向軟骨誘導的可行性。 方法： (1)對臍帶組織進行組織化學和免疫組織化學染色，同時對 Wharon 膠進行葡萄糖胺聚糖 (Glycosaminoglycans， GAGs)和總膠原含量的測定。 (2)從手術臺取足月正常產(chǎn)健康產(chǎn)婦臍帶組織，去除臍血管和外膜組織，剝離 Wharton 膠，采用膠原酶消化法和小組織塊兩種培養(yǎng)方法進行原代培養(yǎng)；對不同代的臍帶 MSCs 進行生長曲線、表面標志、流式細胞檢測表面標志、成纖維細胞集落生成單位 (Colonyforming unitfibroblast， CFUF)、生長周期、凍存與復蘇及逆轉錄 PCR(Reverse transcriptionpolymerase chain raction， RTPCR)分析，并進行番紅 “O” 染色、甲苯胺藍染色以及 Ⅱ 型膠原免疫組化染色進行軟骨特異性標志的鑒定。 (3)在 DMEM 中加入 10％ FBS，10ng/mLTGFβ1 ， 25ng/mL bFGF， 107M地塞米松作為誘導培養(yǎng)基。采用普通誘導培養(yǎng)、密集誘導培養(yǎng)、結合生物反應器技術體外構建無支架軟骨組織。成軟骨細胞表型通過番紅 “O” 染色、甲苯胺蘭染色以及 Ⅱ 型膠原免疫組織 化學染色進行鑒別。 GAGs 定量檢測應用二甲基亞甲蘭法， Ⅱ 型膠原定量檢測通過 ELISA 法。(4)分別對人臍帶 Wharton 膠 MSCs、向軟骨誘導培養(yǎng)后的 MSCs 以及人軟骨細胞進行細胞因子抗體芯片檢測，比較人臍帶 Wharton 膠 MSCs 軟骨誘導前后與正常人軟骨細胞細胞因子表達水平，為同種異體移植奠定實驗基礎 . 結果： (1)人臍帶組織富含膠原和 GAGs， HE染色發(fā)現(xiàn) Wharton 膠中含有大量的間質細胞； (2)采用酶消化法分離可以快速分離 Wharton 膠中間質細胞，并迅速貼壁生長；采用組織塊法培養(yǎng)原代培養(yǎng)時間較 長。流式細胞檢測表明這些細胞表達 CD4 CD10CD271 等 MSCs 標志物；不表達 CD3 CD45 等造血等標志物； HLAABC陽性表達，HLADPDQDR 陰性表達。經(jīng)過凍存復蘇后免疫表型無顯著變化。 (3)未進行軟骨誘導的細胞弱表達軟骨細胞標志，誘導后 GAGs 和 Ⅱ 型膠原定量檢測結果均顯著高于未誘導細胞。 RTPCR結果顯示人臍帶 Wharton膠 MSCs誘導前后均表達 SOX Wharton 膠 MSCs 經(jīng)密集誘導培養(yǎng)后迅速結成膜狀；采用密集誘導培養(yǎng)結合生物反應器培養(yǎng)體外可以構建 大塊無支架組織工程軟骨。 (4)采用細胞因子芯片技術對人臍帶 Wharton 膠 MSCs、誘導后的軟骨細胞以及正常軟骨細胞進行比較分析發(fā)現(xiàn)，臍帶 Wharton 膠干細胞以及誘導后的軟骨細胞在軟骨相關因子表達水平與軟骨細胞接近；同時還表達腫瘤抑制生長因子以及某些神經(jīng)生長因子。 結論： (1)人臍帶 Wharton 膠富含膠原和 GAGs，具有與軟骨組織相似的細胞外基質； (2)人臍帶 Wharton 膠中 MSCs 來源廣泛，無倫理學限制；臍帶Mscs 具有間質干細胞的特性，不向造血系分化； (3)臍帶 MSCs 具有前軟骨細胞的特性，有 望作為軟骨組織工程的新型的種子細胞。臍帶 MSCs 密集誘導培養(yǎng)結合旋轉式細胞培養(yǎng)系統(tǒng)可體外構建大塊無支架組織工程軟骨組織，有望作為新型體外構建軟骨組織的方法。 (4)人臍帶 Wharton 膠 MSCs 以及誘導后的軟骨細胞具有與軟骨細胞相同的表達譜，表明其更為接近軟骨細胞，是較好的軟骨組織工程的種子細胞來源。 關節(jié)軟骨損傷是關節(jié)外科常見的疾病 .軟骨由于其自身的解剖特點，損傷后很難自愈，這也是導致關節(jié)疾病和關節(jié)不穩(wěn)的主要原因。目前，關節(jié)鏡下盥洗術、微骨折技術、馬賽克移植術等治療方法遠期效果均不滿意，最終導致關節(jié)軟骨的退變和骨性關節(jié)炎。采用自體軟骨細胞移植 (Autologous chondrocyte implantation， ACI)能夠實現(xiàn)透明軟骨或透明樣軟骨修復，并取得較好的臨床療效。但 ACI 的缺點是供區(qū)出現(xiàn)新的缺損，需要二次手術，增加患者的痛苦。采用干細胞移植治療軟骨缺損是一個新興的治療手段，并認為間充質干細胞(Mesenchymal stem cells， MSCs)是最有希望的干細胞。 MSCs 是具有自我復制和多向分化潛能的一類多能干細胞。目前， MSCs 主要來源于骨髓，但獲得骨髓時造成患者的痛苦，且骨髓源性間充質干 細胞 (Bone marrow stromal cells，BMSCs)隨著年齡增長其細胞數(shù)量和擴增、分化能力出現(xiàn)明顯下降趨勢，故尋找一種能替代 BMSCs，并可彌補其缺陷干細胞來源，已越來越受到各國學者的關注。胚胎干細胞 (Embryonic stem cells， ESCs)尚存在定向分化和純化的技術障礙，且面臨眾多倫理、法律方面的問題，也有移植后形成畸胎瘤的報道，應用受到一定限制。臍帶屬于胚胎外組織，是胎兒分娩后的廢棄物，組織來源廣泛，無倫理學限制。臍帶由臍帶外膜、臍動脈、臍靜脈以及血管周圍的黏蛋白樣組織，后 者被稱為 Wharton 膠。 本研究目的為探討臍帶 Wharton 膠中干細胞作為軟骨組織工程種子細胞的可行性，并從四個方面進行闡述。第一部分為人臍帶 Wharton膠中的基質成分定性和定量分析的實驗研究；第二部分為人臍帶臍帶 Wharton膠中 MSCs 的分離、培養(yǎng)及生物學性狀的實驗研究；第三部分人臍帶 Wharton 膠中 MSCs 向軟骨誘導培養(yǎng)的實驗研究；第四部分為細胞因子在人臍帶 Wharton 膠間質干細胞及其誘導產(chǎn)生的軟骨細胞的表達 .本研究從組織學、細胞學和組織化學、基因水平和蛋白表達水平探討臍帶 Wharton 膠 及 Wharton 膠中 MSCs 的生物學特性和向軟骨誘導的可行性。 方法： (1)對臍帶組織進行組織化學和免疫組織化學染色，同時對 Wharon 膠進行葡萄糖胺聚糖 (Glycosaminoglycans， GAGs)和總膠原含量的測定。 (2)從手術臺取足月正常產(chǎn)健康產(chǎn)婦臍帶組織，去除臍血管和外膜組織，剝離 Wharton 膠，采用膠原酶消化法和小組織塊兩種培養(yǎng)方法進行原代培養(yǎng)；對不同代的臍帶 MSCs 進行生長曲線、表面標志、流式細胞檢測表面標志、成纖維細胞集落生成單位 (Colonyforming unitfibroblast， CFUF)、生長周期、凍存與復蘇及逆轉錄 PCR(Reverse transcriptionpolymerase chain raction， RTPCR)分析，并進行番紅 “O” 染色、甲苯胺藍染色以及 Ⅱ 型膠原免疫組化染色進行軟骨特異性標志的鑒定。 (3)在 DMEM 中加入 10％ FBS，10ng/mLTGFβ1 ， 25ng/mL bFGF， 107M地塞米松作為誘導培養(yǎng)基。采用普通誘導培養(yǎng)、密集誘導培養(yǎng)、結合生物反應器技術體外構建無支架軟骨組織。成軟骨細胞表型通過番紅 “O” 染色、甲苯胺蘭染色以及 Ⅱ 型膠 原免疫組織化學染色進行鑒別。 GAGs 定量檢測應用二甲基亞甲蘭法， Ⅱ 型膠原定量檢測通過 ELISA 法。(4)分別對人臍帶 Wharton 膠 MSCs、向軟骨誘導培養(yǎng)后的 MSCs 以及人軟骨細胞進行細胞因子抗體芯片檢測，比較人臍帶 Wharton 膠 MSCs 軟骨誘導前后與正常人軟骨細胞細胞因子表達水平，為同種異體移植奠定實驗基礎 . 結果： (1)人臍帶組織富含膠原和 GAGs， HE染色發(fā)現(xiàn) Wharton 膠中含有大量的間質細胞； (2)采用酶消化法分離可以快速分離 Wharton 膠中間質細胞，并迅速貼壁生長；采用組織塊法培養(yǎng)原代 培養(yǎng)時間較長。流式細胞檢測表明這些細胞表達 CD4 CD10CD271 等 MSCs 標志物；不表達 CD3 CD45 等造血等標志物； HLAABC陽性表達，HLADPDQDR 陰性表達。經(jīng)過凍存復蘇后免疫表型無顯著變化。 (3)未進行軟骨誘導的細胞弱表達軟骨細胞標志，誘導后 GAGs 和 Ⅱ 型膠原定量檢測結果均顯著高于未誘導細胞。 RTPCR結果顯示人臍帶 Wharton膠 MSCs誘導前后均表達 SOX Wharton 膠 MSCs 經(jīng)密集誘導培養(yǎng)后迅速結成膜狀；采用密集誘導培養(yǎng)結合生物反應器培養(yǎng)體 外可以構建大塊無支架組織工程軟骨。 (4)采用細胞因子芯片技術對人臍