細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)ppt課件(編輯修改稿)
2025-06-17 01:19 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 驟 （一）準(zhǔn)備 (清洗與滅菌） （二） 合成培養(yǎng)基（ RPMI 1640 ）的配制 配制 100ml RPMI 1640母液： 每 4小組合稱(chēng) RPMI 1640干粉 ，溶于 100ml的 3DW。 置于攪拌器上攪拌 40分鐘，直到液體變?yōu)槌吻鍨橹埂? 通入 CO2，使液體變?yōu)榻瘘S色，說(shuō)明培養(yǎng)基完全溶好。 溶好以后置于超凈臺(tái)中進(jìn)行 濾過(guò)除菌，分裝至試劑瓶中。 瓶口封好， 20℃ 或 4℃ 貯存。 （三）小牛血清的處理 ?新買(mǎi)的新生小牛血清一定要滅活； ?將新生小牛血清不開(kāi)封置于 56℃ 水浴鍋中 30min,期間要不時(shí)輕輕晃動(dòng)，使受熱均勻，防止沉淀析出。 ?已滅活的血清貯存于 4℃ 。 （四）生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制 1．雙抗：（ 100000u/ml） ? 160萬(wàn)單位青霉素 /瓶 +8ml 3DW = 20萬(wàn)單位 /ml ? 1g鏈霉素 +5ml 3DW = 202100ug/ml ? 各取以上的液體 5ml混合，使其濃度為 10萬(wàn)單位/ml， ， 20℃ 貯存。 2．谷氨酰胺儲(chǔ)備液（ 200mM） ： ? 50ml3DW中（ 30mg/ml=200mM),。 ? 20℃ 貯存。 ? 注： 200mM=200mmol/L（毫摩爾每升 ) NaHCO3的配制 ?每組稱(chēng)取 10g的 NaHCO3溶于 200ml 3DW 中，過(guò)濾除菌后分裝于 50ml試劑瓶。 ?4℃ 保存 4. RPMI 1640生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制 50毫升 儲(chǔ)備液濃 度 終濃度 RPMI 1640培養(yǎng)液 44 — — 谷氨酰胺 30mg/ml 雙抗 100000u/ml 100u/ml 小牛血清 5 — 10% NaHCO3調(diào) pH至 七、思考題： ? 血清在細(xì)胞培養(yǎng)中有何作用？ ? 為什么配制培養(yǎng)基之前要反復(fù)處理配制用水并要事先高壓處理？ ? 配制培養(yǎng)基時(shí)調(diào)節(jié) pH值的目的是什么？ 六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 ? 寫(xiě)出各自配制試劑的步驟。 ? 敘述配制過(guò)程中所觀察到的現(xiàn)象。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? 熟練掌握細(xì)胞傳代培養(yǎng)的操作方法。 ? 觀察外培細(xì)胞在不同時(shí)期的形態(tài)變化及生長(zhǎng)狀況。 實(shí)驗(yàn)五 宮頸癌 HeLa細(xì)胞株培養(yǎng) 三、細(xì)胞傳代培養(yǎng) 二、實(shí)驗(yàn)原理 ? 貼壁細(xì)胞指的是體外培養(yǎng)條件下，必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)的細(xì)胞，貼壁后一般呈纖維樣細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞兩種形態(tài)。貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)瓶長(zhǎng)成致密單層厚，繼續(xù)生長(zhǎng)的空間不足，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分也消耗較多，同時(shí)代謝廢物也有較多堆積，需進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代擴(kuò)增。 ? 對(duì)于貼壁不太緊的細(xì)胞如 colo320，可以直接吹散后分瓶。而對(duì)于貼壁較緊的細(xì)胞如HeLa、 colo205貼壁細(xì)胞，則需要以細(xì)胞消化液消化后才能脫落和分散。 ? 常用的消化液為胰蛋白酶。 胰酶消化的原理： ? 胰酶是一種蛋白酶，通過(guò)特定位置上降解蛋白，使細(xì)胞膜上和培養(yǎng)瓶壁結(jié)合處蛋白降解，致使兩者分離。這時(shí)細(xì)胞由于自身內(nèi)部細(xì)胞骨架的張力以及培養(yǎng)液表面張力作用下成為球形。 細(xì)胞消化用胰蛋白酶常用的工作液濃度為%， PH為 。 ? 胰酶消化的程度是一個(gè)關(guān)鍵：消化過(guò)度會(huì)對(duì)細(xì)胞活性損傷較大，并有部分細(xì)胞漂浮，隨棄去的胰酶流失，甚至造成細(xì)胞破碎；消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁吹下，反復(fù)吹打同樣也會(huì)損傷細(xì)胞活性。 ? 一般消化時(shí)間為 1至 3分鐘，肉眼觀察瓶壁由半透明轉(zhuǎn)為點(diǎn)狀透明時(shí)，棄去胰酶，并加入適量的有血清培養(yǎng)液終止消化，吹打分散。 三、儀器、材料和試劑 ? 超凈工作臺(tái) 微量加樣器（移液槍?zhuān)? ? 倒置顯微鏡 高壓滅菌鍋 ? 蒸餾水器 超低溫冰箱 ? 二氧化碳培養(yǎng)箱 （一）儀器 （二）用具、材料 ? 細(xì)胞培養(yǎng)瓶 ? 滴管 ? 培養(yǎng)細(xì)胞 四、實(shí)驗(yàn)步驟 1. RPMI 1640生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制 50毫升 儲(chǔ)備液濃 度 終濃度 RPMI 1640培養(yǎng)液 44 — — 谷氨酰胺 30mg/ml 雙抗 100000u/ml 100u/ml 小牛血清 5 — 10% NaHCO3調(diào) pH至 傳代培養(yǎng)步驟（以下均為無(wú)菌操作） ? 從培養(yǎng)箱中取出原代培養(yǎng)細(xì)胞并置于超凈工作臺(tái)，棄去培養(yǎng)液，加入 %胰酶溶液，以使細(xì)胞貼壁面充分浸潤(rùn)，當(dāng)見(jiàn)到細(xì)胞貼壁面的瓶壁出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)，棄去胰酶溶液，并加入適量培養(yǎng)液終止消化，吹打分散。 ? 細(xì)胞計(jì)數(shù)：取 5ul細(xì)胞懸浮液加入等量臺(tái)盼藍(lán)染液，混勻后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞的成活率。如果樣本成活率高，無(wú)污染即可用于傳代。 (計(jì)數(shù)結(jié)果： 106個(gè) /ml)。 ? 將細(xì)胞分裝至新鮮的培養(yǎng)液中，使細(xì)胞的最終數(shù)量調(diào)節(jié)至 1 105～ 3 105個(gè) /mL。 ? 置于 37℃ 二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 具體操作： 每?jī)蓚€(gè)小組共用一個(gè)培養(yǎng)瓶配制 100ml的 生長(zhǎng)培養(yǎng)基 每人取 10ml培養(yǎng)基到自己的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi) 向細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)接種 400ul的 HeLa細(xì)胞株原液 放入二氧化碳培養(yǎng)箱， 旋松瓶蓋 根據(jù)細(xì)胞的數(shù)量看細(xì)胞瓶是否平放或直立放置 觀察 ? 倒置顯微鏡的使用方法 ? 利用課余時(shí)間和下次實(shí)驗(yàn)課時(shí)間用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察。 五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告 ? 描繪在倒置顯微鏡下觀察到的現(xiàn)象。 六、思考題 ? 如何防止傳代過(guò)程的可能污染？ 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? ? 掌握死活細(xì)胞的鑒別原理及方法。 四、死活細(xì)胞的鑒別 實(shí)驗(yàn)五 宮頸癌 HeLa細(xì)胞株培養(yǎng) 二、實(shí)驗(yàn)原理 ? 細(xì)胞的存活率是反映細(xì)胞群體生活狀態(tài)的重要指標(biāo)。多種方法可以鑒別細(xì)胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。其原理是：許多酸性物質(zhì)不容易穿過(guò)活細(xì)胞的質(zhì)膜進(jìn)入胞內(nèi)，卻能滲入死亡的細(xì)胞內(nèi)，使其著色，以此來(lái)區(qū)別死活細(xì)胞。 三、材料和試劑 ? 材料： HeLa細(xì)胞株 ? 試劑： %臺(tái)盼藍(lán)溶液（ 生理鹽水配制why？ ） 四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟 ? 將細(xì)胞懸液充分混勻后取 20ul放入干凈的離心管中，加入等體積的 %的臺(tái)盼藍(lán)染液混合，放置 2min。 ? 取一干凈的血球計(jì)數(shù)板，蓋上蓋片，從蓋片兩邊滴入細(xì)胞懸液使之充滿(mǎn)計(jì)數(shù)板和蓋片之間。注意滴液勿有氣泡，也不能太多（約 10ul），否則會(huì)使蓋片浮起而是細(xì)胞計(jì)數(shù)不準(zhǔn)。 ? 低倍鏡下觀察，活細(xì)胞不著色，臺(tái)盼藍(lán)著色的細(xì)
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