細胞生物學(xué)實驗ppt課件(編輯修改稿)
2025-06-17 01:19 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 驟 （一）準備 (清洗與滅菌） （二） 合成培養(yǎng)基（ RPMI 1640 ）的配制 配制 100ml RPMI 1640母液： 每 4小組合稱 RPMI 1640干粉 ，溶于 100ml的 3DW。 置于攪拌器上攪拌 40分鐘，直到液體變?yōu)槌吻鍨橹埂? 通入 CO2，使液體變?yōu)榻瘘S色，說明培養(yǎng)基完全溶好。 溶好以后置于超凈臺中進行 濾過除菌，分裝至試劑瓶中。 瓶口封好， 20℃ 或 4℃ 貯存。 （三）小牛血清的處理 ?新買的新生小牛血清一定要滅活； ?將新生小牛血清不開封置于 56℃ 水浴鍋中 30min,期間要不時輕輕晃動，使受熱均勻，防止沉淀析出。 ?已滅活的血清貯存于 4℃ 。 （四）生長培養(yǎng)基的配制 1．雙抗：（ 100000u/ml） ? 160萬單位青霉素 /瓶 +8ml 3DW = 20萬單位 /ml ? 1g鏈霉素 +5ml 3DW = 202100ug/ml ? 各取以上的液體 5ml混合，使其濃度為 10萬單位/ml， ， 20℃ 貯存。 2．谷氨酰胺儲備液（ 200mM） ： ? 50ml3DW中（ 30mg/ml=200mM),。 ? 20℃ 貯存。 ? 注： 200mM=200mmol/L（毫摩爾每升 ) NaHCO3的配制 ?每組稱取 10g的 NaHCO3溶于 200ml 3DW 中，過濾除菌后分裝于 50ml試劑瓶。 ?4℃ 保存 4. RPMI 1640生長培養(yǎng)基的配制 50毫升 儲備液濃 度 終濃度 RPMI 1640培養(yǎng)液 44 — — 谷氨酰胺 30mg/ml 雙抗 100000u/ml 100u/ml 小牛血清 5 — 10% NaHCO3調(diào) pH至 七、思考題： ? 血清在細胞培養(yǎng)中有何作用？ ? 為什么配制培養(yǎng)基之前要反復(fù)處理配制用水并要事先高壓處理？ ? 配制培養(yǎng)基時調(diào)節(jié) pH值的目的是什么？ 六、實驗報告 ? 寫出各自配制試劑的步驟。 ? 敘述配制過程中所觀察到的現(xiàn)象。 一、實驗?zāi)康? ? 熟練掌握細胞傳代培養(yǎng)的操作方法。 ? 觀察外培細胞在不同時期的形態(tài)變化及生長狀況。 實驗五 宮頸癌 HeLa細胞株培養(yǎng) 三、細胞傳代培養(yǎng) 二、實驗原理 ? 貼壁細胞指的是體外培養(yǎng)條件下，必須貼附于支持物表面才能生長的細胞，貼壁后一般呈纖維樣細胞或上皮樣細胞兩種形態(tài)。貼壁細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層厚，繼續(xù)生長的空間不足，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分也消耗較多，同時代謝廢物也有較多堆積，需進行分瓶培養(yǎng)，對細胞進行傳代擴增。 ? 對于貼壁不太緊的細胞如 colo320，可以直接吹散后分瓶。而對于貼壁較緊的細胞如HeLa、 colo205貼壁細胞，則需要以細胞消化液消化后才能脫落和分散。 ? 常用的消化液為胰蛋白酶。 胰酶消化的原理： ? 胰酶是一種蛋白酶，通過特定位置上降解蛋白，使細胞膜上和培養(yǎng)瓶壁結(jié)合處蛋白降解，致使兩者分離。這時細胞由于自身內(nèi)部細胞骨架的張力以及培養(yǎng)液表面張力作用下成為球形。 細胞消化用胰蛋白酶常用的工作液濃度為%， PH為 。 ? 胰酶消化的程度是一個關(guān)鍵：消化過度會對細胞活性損傷較大，并有部分細胞漂浮，隨棄去的胰酶流失，甚至造成細胞破碎；消化不足則細胞難于從瓶壁吹下，反復(fù)吹打同樣也會損傷細胞活性。 ? 一般消化時間為 1至 3分鐘，肉眼觀察瓶壁由半透明轉(zhuǎn)為點狀透明時，棄去胰酶，并加入適量的有血清培養(yǎng)液終止消化，吹打分散。 三、儀器、材料和試劑 ? 超凈工作臺 微量加樣器（移液槍） ? 倒置顯微鏡 高壓滅菌鍋 ? 蒸餾水器 超低溫冰箱 ? 二氧化碳培養(yǎng)箱 （一）儀器 （二）用具、材料 ? 細胞培養(yǎng)瓶 ? 滴管 ? 培養(yǎng)細胞 四、實驗步驟 1. RPMI 1640生長培養(yǎng)基的配制 50毫升 儲備液濃 度 終濃度 RPMI 1640培養(yǎng)液 44 — — 谷氨酰胺 30mg/ml 雙抗 100000u/ml 100u/ml 小牛血清 5 — 10% NaHCO3調(diào) pH至 傳代培養(yǎng)步驟（以下均為無菌操作） ? 從培養(yǎng)箱中取出原代培養(yǎng)細胞并置于超凈工作臺，棄去培養(yǎng)液，加入 %胰酶溶液，以使細胞貼壁面充分浸潤，當(dāng)見到細胞貼壁面的瓶壁出現(xiàn)細針孔空隙時，棄去胰酶溶液，并加入適量培養(yǎng)液終止消化，吹打分散。 ? 細胞計數(shù)：取 5ul細胞懸浮液加入等量臺盼藍染液，混勻后用血球計數(shù)板計算細胞的成活率。如果樣本成活率高，無污染即可用于傳代。 (計數(shù)結(jié)果： 106個 /ml)。 ? 將細胞分裝至新鮮的培養(yǎng)液中，使細胞的最終數(shù)量調(diào)節(jié)至 1 105～ 3 105個 /mL。 ? 置于 37℃ 二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。 具體操作： 每兩個小組共用一個培養(yǎng)瓶配制 100ml的 生長培養(yǎng)基 每人取 10ml培養(yǎng)基到自己的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi) 向細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)接種 400ul的 HeLa細胞株原液 放入二氧化碳培養(yǎng)箱， 旋松瓶蓋 根據(jù)細胞的數(shù)量看細胞瓶是否平放或直立放置 觀察 ? 倒置顯微鏡的使用方法 ? 利用課余時間和下次實驗課時間用倒置顯微鏡進行觀察。 五、實驗報告 ? 描繪在倒置顯微鏡下觀察到的現(xiàn)象。 六、思考題 ? 如何防止傳代過程的可能污染？ 一、實驗?zāi)康? ? 掌握死活細胞的鑒別原理及方法。 四、死活細胞的鑒別 實驗五 宮頸癌 HeLa細胞株培養(yǎng) 二、實驗原理 ? 細胞的存活率是反映細胞群體生活狀態(tài)的重要指標。多種方法可以鑒別細胞的死活，最常用到的方法是染色排除法。其原理是：許多酸性物質(zhì)不容易穿過活細胞的質(zhì)膜進入胞內(nèi)，卻能滲入死亡的細胞內(nèi)，使其著色，以此來區(qū)別死活細胞。 三、材料和試劑 ? 材料： HeLa細胞株 ? 試劑： %臺盼藍溶液（ 生理鹽水配制why？ ） 四、實驗方法與步驟 ? 將細胞懸液充分混勻后取 20ul放入干凈的離心管中，加入等體積的 %的臺盼藍染液混合，放置 2min。 ? 取一干凈的血球計數(shù)板，蓋上蓋片，從蓋片兩邊滴入細胞懸液使之充滿計數(shù)板和蓋片之間。注意滴液勿有氣泡，也不能太多（約 10ul），否則會使蓋片浮起而是細胞計數(shù)不準。 ? 低倍鏡下觀察，活細胞不著色，臺盼藍著色的細
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