【文章內(nèi)容簡介】 submicroscopic structures）。 透射電鏡 光學顯微鏡 電子束通過標本時，根據(jù)標本各部位密度的不同，部分電子發(fā)生散射，只有剩余的電子成像，經(jīng)物鏡和投射鏡放大后投射到照相底片或熒屏上。 由于散射的電子不參加成像，故標本中密度大的部分成像后形成電子流量減少的暗區(qū)；相反密度小的部分散射電子少而形成明區(qū)。 2. 透射電鏡生物標本制作： ⑴ 取材 ⑵ 固定 ：防止產(chǎn)生結構改變。 戊二醛：在蛋白質分子之間形成共價鍵 , 將它們交聯(lián)在一起。 四氧化鋨：除與蛋白共價結合外，還對脂類有良好的固定效果。 (3)脫水 ：標本必須置于高真空中進行電鏡觀察 ,所以電鏡生物標本不能含水。梯度乙醇。 (4)包埋 ：為使柔軟生物組織制成超薄切片 ,并使切片耐受高真空、電子轟擊，應在切片前將標本進行包埋 ,常用 環(huán)氧樹脂 。 (5)切片 ：電子穿透力很弱 ,需將樣品制成 50～ 100nm厚薄片。約為細胞的 1/200厚度。 (6)染色 ：生物分子由原子序數(shù)低的輕元素組成，它們散射電子能力弱 ,在電鏡下幾乎不存在明暗反差 ,需加大生物樣品反差，進行染色。重金屬浸染。 透射電鏡提高樣品反差的方法 原理： 用只 沉積于樣品周圍的、 比樣品密度高的物質 (如磷鎢酸 )對樣品進行染色， 使樣品和背景形成顯著的明暗對比 ,這種染背景而不染樣品的方法叫負染 。 應用： 適用于顆粒或纖維等游離的樣品。特別是在病毒性致病因子的超微病理診斷中廣泛應用。 （ 1）負染技術 冰凍蝕刻 freezeetching 標本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結構。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復膜（ replica）。 隨樣品表面結構的高低起伏，重金屬形成不同厚度的薄膜，顯示了投影效果，給出了一個樣品表面結構的三維圖像。 電鏡三維重建技術 （二）掃描電子顯微鏡 （ Scanning electron microscope， SEM） 掃描電鏡的成像原理 陰極鎢絲加熱后產(chǎn)生的電子束經(jīng)過柵極和陽極加速和會聚，再經(jīng)二級聚光鏡及物鏡會聚形成 具有一定能量、一定束流強度和束斑直徑的微細電子束； 電子束在掃描線圈驅動下，在試樣表面按一定時間、空間順序作柵網(wǎng)式掃描。聚焦電子束與試樣相互作用，產(chǎn)生二次電子發(fā)射。 二次電子發(fā)射量隨試樣表面形貌而變化 ； 二次電子信號被收集、轉換、放大，在電視熒光屏上同步掃描成像。 Scanning electron microscopy. Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A). For parison, the same structure is shown by differentialinterferencecontrast light microscopy (B) and by thinsection electron microscopy (C). 蛙的內(nèi)耳毛細胞 （三）掃描隧道顯微鏡 （ scanning tunneling microscope， STM） 原理： 根據(jù)隧道效應而設計，當原子尺度的針尖在一定高度（ 100nm以內(nèi)）上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（ 2mV~2V），針尖與樣品之間形成 隧道電流 。電流強度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關系，將掃描過程中電流的變化轉換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。 分辨率： 橫向為 ~，縱向可達 。 用途： 三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質均可進行觀察。 第二節(jié) 細胞組分的分離及分析技術 一、細胞組分的分離 ——離心技術 是分離細胞器（如細胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子基本手段 。 轉速為 10~25kr/min的離心機稱為 高速離心機 。 轉速 25kr/min，離心力 89Kｇ 者稱為 超速離心機 。 目前超速離心機的最高轉速可達 100000r/min。 （一）差速離心 Differential centrifugation 特點： ——介質密度均一； ——速度由低向高，逐級離心。 用途： 分離大小相差懸殊的細胞和細胞器。 沉降順序： 核 →線粒體 →溶酶體與過氧化物酶體 →內(nèi)質網(wǎng)與高基體 →核蛋白體。 可將細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。 （二）密度梯度離心 用介質在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過離心力場的作用使細胞分層、分離。 類型： 速度沉降、等密度沉降。 常用介質： 氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 分離活細胞的 介質要求 ： 1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高； 2） pH中性或易調為中性； 3）濃度大時滲透壓不大； 4）對細胞無毒。 速度沉降 velocity sedimentation 用途 ：分離 密度相近而大小不等 的細胞或細胞器。 原理 ：介質密度梯度平緩，分離物按各自的 沉降系數(shù) 以不同的速度沉降而達到分離的目的。 特點 ：介質密度較低， 介質的最大