細(xì)胞生物學(xué)研究方法(2)(編輯修改稿)
2025-02-12 21:16 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 submicroscopic structures）。 透射電鏡 光學(xué)顯微鏡 電子束通過(guò)標(biāo)本時(shí)，根據(jù)標(biāo)本各部位密度的不同，部分電子發(fā)生散射，只有剩余的電子成像，經(jīng)物鏡和投射鏡放大后投射到照相底片或熒屏上。 由于散射的電子不參加成像，故標(biāo)本中密度大的部分成像后形成電子流量減少的暗區(qū)；相反密度小的部分散射電子少而形成明區(qū)。 2. 透射電鏡生物標(biāo)本制作： ⑴ 取材 ⑵ 固定 ：防止產(chǎn)生結(jié)構(gòu)改變。 戊二醛：在蛋白質(zhì)分子之間形成共價(jià)鍵 , 將它們交聯(lián)在一起。 四氧化鋨：除與蛋白共價(jià)結(jié)合外，還對(duì)脂類有良好的固定效果。 (3)脫水 ：標(biāo)本必須置于高真空中進(jìn)行電鏡觀察 ,所以電鏡生物標(biāo)本不能含水。梯度乙醇。 (4)包埋 ：為使柔軟生物組織制成超薄切片 ,并使切片耐受高真空、電子轟擊，應(yīng)在切片前將標(biāo)本進(jìn)行包埋 ,常用 環(huán)氧樹(shù)脂 。 (5)切片 ：電子穿透力很弱 ,需將樣品制成 50～ 100nm厚薄片。約為細(xì)胞的 1/200厚度。 (6)染色 ：生物分子由原子序數(shù)低的輕元素組成，它們散射電子能力弱 ,在電鏡下幾乎不存在明暗反差 ,需加大生物樣品反差，進(jìn)行染色。重金屬浸染。 透射電鏡提高樣品反差的方法 原理： 用只 沉積于樣品周圍的、 比樣品密度高的物質(zhì) (如磷鎢酸 )對(duì)樣品進(jìn)行染色， 使樣品和背景形成顯著的明暗對(duì)比 ,這種染背景而不染樣品的方法叫負(fù)染 。 應(yīng)用： 適用于顆?；蚶w維等游離的樣品。特別是在病毒性致病因子的超微病理診斷中廣泛應(yīng)用。 （ 1）負(fù)染技術(shù) 冰凍蝕刻 freezeetching 標(biāo)本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開(kāi)，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結(jié)構(gòu)。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來(lái)，此膜即為復(fù)膜（ replica）。 隨樣品表面結(jié)構(gòu)的高低起伏，重金屬形成不同厚度的薄膜，顯示了投影效果，給出了一個(gè)樣品表面結(jié)構(gòu)的三維圖像。 電鏡三維重建技術(shù) （二）掃描電子顯微鏡 （ Scanning electron microscope， SEM） 掃描電鏡的成像原理 陰極鎢絲加熱后產(chǎn)生的電子束經(jīng)過(guò)柵極和陽(yáng)極加速和會(huì)聚，再經(jīng)二級(jí)聚光鏡及物鏡會(huì)聚形成 具有一定能量、一定束流強(qiáng)度和束斑直徑的微細(xì)電子束； 電子束在掃描線圈驅(qū)動(dòng)下，在試樣表面按一定時(shí)間、空間順序作柵網(wǎng)式掃描。聚焦電子束與試樣相互作用，產(chǎn)生二次電子發(fā)射。 二次電子發(fā)射量隨試樣表面形貌而變化 ； 二次電子信號(hào)被收集、轉(zhuǎn)換、放大，在電視熒光屏上同步掃描成像。 Scanning electron microscopy. Scanning electron micrograph of the stereocilia projecting from a hair cell in the inner ear of a bullfrog (A). For parison, the same structure is shown by differentialinterferencecontrast light microscopy (B) and by thinsection electron microscopy (C). 蛙的內(nèi)耳毛細(xì)胞 （三）掃描隧道顯微鏡 （ scanning tunneling microscope， STM） 原理： 根據(jù)隧道效應(yīng)而設(shè)計(jì)，當(dāng)原子尺度的針尖在一定高度（ 100nm以內(nèi)）上掃描樣品時(shí)，此處電子云重疊，外加一電壓（ 2mV~2V），針尖與樣品之間形成 隧道電流 。電流強(qiáng)度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關(guān)系，將掃描過(guò)程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。 分辨率： 橫向?yàn)?~，縱向可達(dá) 。 用途： 三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進(jìn)行觀察。 第二節(jié) 細(xì)胞組分的分離及分析技術(shù) 一、細(xì)胞組分的分離 ——離心技術(shù) 是分離細(xì)胞器（如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子基本手段 。 轉(zhuǎn)速為 10~25kr/min的離心機(jī)稱為 高速離心機(jī) 。 轉(zhuǎn)速 25kr/min，離心力 89Kｇ 者稱為 超速離心機(jī) 。 目前超速離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá) 100000r/min。 （一）差速離心 Differential centrifugation 特點(diǎn)： ——介質(zhì)密度均一； ——速度由低向高，逐級(jí)離心。 用途： 分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。 沉降順序： 核 →線粒體 →溶酶體與過(guò)氧化物酶體 →內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體 →核蛋白體。 可將細(xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過(guò)密度梯離心再行分離純化。 （二）密度梯度離心 用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過(guò)離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。 類型： 速度沉降、等密度沉降。 常用介質(zhì)： 氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 分離活細(xì)胞的 介質(zhì)要求 ： 1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高； 2） pH中性或易調(diào)為中性； 3）濃度大時(shí)滲透壓不大； 4）對(duì)細(xì)胞無(wú)毒。 速度沉降 velocity sedimentation 用途 ：分離 密度相近而大小不等 的細(xì)胞或細(xì)胞器。 原理 ：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的 沉降系數(shù) 以不同的速度沉降而達(dá)到分離的目的。 特點(diǎn) ：介質(zhì)密度較低， 介質(zhì)的最大
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