【文章內(nèi)容簡介】 　　7．資料分析　將資料進(jìn)行分類，并加以說明，以便做出結(jié)論。也可將資料貯存，隨意可提取出來，供研究者使用?！　?．其他事項(xiàng)　　（1）標(biāo)本要清潔：如果標(biāo)本上有污點(diǎn)，研究者可分辨哪些是正常的免疫反應(yīng)產(chǎn)物，哪些是污染引起的，但儀器不會區(qū)別，只要是電視屏幕上測量框內(nèi)有的東西都會被測量，如測灰度時(shí)切片上有污點(diǎn)，會影響結(jié)果?！　。?）電壓要穩(wěn)定：這一點(diǎn)是結(jié)合我國目前情況而言，雖然儀器使用時(shí)是通過穩(wěn)壓器的，也要經(jīng)常注意穩(wěn)壓器上的電壓指針是否穩(wěn)定，否則也影響結(jié)果?！　。?）價(jià)格問題：圖像分析儀廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，因此并不是價(jià)格愈貴就愈好，而要看我們的應(yīng)用目的及其性能，以免購置一些用不著的昂貴的附件而造成浪費(fèi)。一般可以從以下三方面來考察儀器性能：在本專業(yè)范圍內(nèi)應(yīng)用的廣度、運(yùn)算的速度和操作的方便程度?！　。?）合作使用：分析儀價(jià)格昂貴，根據(jù)國內(nèi)目前實(shí)際情況，有些工廠購置了圖像儀而僅僅用作工業(yè)金相分析，閑置的時(shí)間很多，我們從事醫(yī)學(xué)研究的人可以去充分利用它的性能，聯(lián)合進(jìn)行科研工作，發(fā)四川省目前最高級的圖像分析儀就是在工廠中而不是在高等學(xué)校中。　　五、沒有圖像分析儀可否進(jìn)行圖像分析？　　當(dāng)沒有圖像分析儀時(shí)，研究者早已想到用網(wǎng)格來進(jìn)行圖像分析，也獲得了客觀的評定結(jié)果。網(wǎng)格可分為兩大類：一類是置于目鏡內(nèi)的網(wǎng)格，可測量切片標(biāo)本上的各種數(shù)據(jù)；另一類是大的網(wǎng)格，可放在照片上，光鏡電鏡照片均可用，對照片上的各種結(jié)構(gòu)可進(jìn)行測量。以上二者至今仍被采用。英國標(biāo)線片公司提供許多型號的市售標(biāo)線片（即網(wǎng)格）。有的國家制造的顯微鏡，將目鏡與帶有六種不同型號標(biāo)線片的旋轉(zhuǎn)盤裝在一起，以便于觀察者作各種測量。國內(nèi)某些單位有自制標(biāo)線片，并有少量出售?！　alto等1982年曾在“免疫組織化學(xué)的形態(tài)測量法一卵巢腫瘤內(nèi)的胚性癌抗原”一文中推薦用視野評分法，他用三種方法對PAP法免疫組化標(biāo)本進(jìn)行分析：①對全切片的染色進(jìn)行分級。②在1010放大倍數(shù)下，每一切片用目鏡網(wǎng)格任選25個(gè)方形視場進(jìn)行觀察，并對每一視場進(jìn)行分級。③在25個(gè)視場內(nèi)取25個(gè)點(diǎn)的著色強(qiáng)度進(jìn)行分級。染色強(qiáng)度分為0級、1級（輕度）2級、（中度）、3級（重度）。方法①的結(jié)果不同于②③，而方法②和③差別不大，說明主觀估算的鑒別能力低，一般鏡下觀察不能確切反映染色強(qiáng)度。　　用網(wǎng)格進(jìn)行圖像分析的方法很多，如用免疫熒光等方法顯示神經(jīng)纖維，要表示各處的纖維密度不同，除了文字描述如致密、稀疏等以外，用網(wǎng)格法就要客觀一些，在目鏡或照片上放上網(wǎng)格，觀察陽性神經(jīng)纖維與網(wǎng)格上的線條的交叉次數(shù)，排列密集的區(qū)域交叉次數(shù)必然多些，這就比較客觀，重復(fù)性也較好?！　∮脽晒怙@微鏡觀察免疫熒光標(biāo)本，Ploem曾在1977年指出熒光強(qiáng)度之差至少要二倍才能在直觀估計(jì)時(shí)顯示出差別，說明人視覺對熒光強(qiáng)度變化不夠敏感。作者在工作中體會到，可利用照相的自動曝光系統(tǒng)來作相對定量，因?yàn)闊晒庥鷱?qiáng)則自動曝光時(shí)間愈短，熒光弱則自動曝光時(shí)間長，相當(dāng)敏感，用眼睛觀察二個(gè)熒光強(qiáng)度幾乎無差別的細(xì)胞，也能在自動曝光時(shí)間上顯示出差別來。作者曾經(jīng)將許多熒光標(biāo)本用相同的曝光時(shí)間拍在同一個(gè)膠卷中，沖洗后，熒光強(qiáng)的區(qū)域膠卷上顯色深，熒光弱的區(qū)域膠卷上顯色淺，因?yàn)闊晒馊菀状銣?，用此法可將膠卷較長期保存，而且膠卷上的信息還可通過圖像分析儀測灰度等數(shù)據(jù)。這些都是在實(shí)踐中的一點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)，供讀者參考?！　∮镁W(wǎng)格測量的具體操作舉例：圖94為一關(guān)聯(lián)方測格，由于測點(diǎn)、測線、測面之間有互相關(guān)聯(lián)的關(guān)系，故稱為關(guān)聯(lián)方測格。方格直線交叉稱為測點(diǎn)，總數(shù)為100個(gè)，方格中所有直線稱為測線，小方格邊長為d如圖中所示，測線總長度為200d,整個(gè)大方格為測面，測面總面積為100d2，測格周圍的虛線不是測線。關(guān)聯(lián)測格的優(yōu)點(diǎn)是：只在計(jì)數(shù)位于欲測圖像中的測點(diǎn)數(shù)P，就可計(jì)算位于該圖像中的測線長度L及測面的面積A。計(jì)算方法為：L=2dP，A=d2P?！　】蓪D94攝制于小的透明膠片上，剪成你所用的目鏡筒的內(nèi)徑大小，將其置于目鏡內(nèi)，使測格清晰地疊映組織標(biāo)本的圖像上，則可進(jìn)行測量。d的長度可用臺微尺來確定。也可將94復(fù)印在較大的透明膠片上，可用來測量電鏡照片或光鏡照片，將透明膠片疊加在照片上即可進(jìn)行測量。圖95為一測量的例子：圖9－4　關(guān)聯(lián)方測格圖95 示測點(diǎn)計(jì)數(shù)　　此關(guān)聯(lián)方測格共有測點(diǎn)100個(gè)（如果只計(jì)數(shù)粗測點(diǎn)則有25個(gè)），圖像為一個(gè)腎小體的輪廓，包括血管球和腎小囊腔，測點(diǎn)計(jì)數(shù)的結(jié)果，在腎小囊腔內(nèi)的測點(diǎn)數(shù)為12，在血管球內(nèi)的測點(diǎn)為49個(gè)，整個(gè)腎小體內(nèi)的測點(diǎn)為12+49=61個(gè)，用臺微尺測出d的長度，則可得到此圖像中腎小囊腔的面積，血管球的面積，腎小體的面積。明小囊腔與腎小體的面積比12：61=%等多個(gè)參數(shù)?！　≈档锰岢龅氖?，在顯微鏡下網(wǎng)格的線條有一定寬度，如圖96所示。計(jì)數(shù)測點(diǎn)時(shí)如①箭頭所示，即橫線上緣與豎線右緣交點(diǎn)處為真正的測點(diǎn)，若此點(diǎn)落在圖像外面則不能計(jì)數(shù)。如②箭頭所示，此測線的上緣才能作為真正的測線。圖96 示真正的測點(diǎn)與測線　　表面積密度的測定：免疫細(xì)胞化學(xué)電鏡照片中的膜性結(jié)構(gòu)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、細(xì)胞膜等都可測定表面積密度，光鏡標(biāo)本中的各種結(jié)構(gòu)也可同樣測定。表面積密度是指單位體積參照空間內(nèi)特征物的表面積，通過數(shù)學(xué)運(yùn)算可簡便地用以下方法測定：測量單位面積參照面內(nèi)特征物斷面周界線的長度。如果某一個(gè)細(xì)胞的電鏡照片作為參照面，線粒體作為特征物，欲測單位面積電鏡照片內(nèi)線粒體斷面周界線的長度，可用以下公式：　　SV=2IL　　SV表面積密度2IL交點(diǎn)密度　　IL=測線與特征物斷面周界線之間的交叉點(diǎn)數(shù)除以參照面內(nèi)測線總長度?！　D97為一咱擺線測格，可用來方便地測表面積密度。圖中的平行直線不是測線，僅是為了便于計(jì)數(shù)交叉點(diǎn)和測點(diǎn)而畫上的。圖中的曲線即擺線，也就是測線，共45條，每條擺線長度d=1/10測格寬度(1cycloid arc =1/10frame width) ，測格的寬度容易測量，如用目鏡測格，可用臺微尺測量，如用大的透明膠片，可實(shí)際用尺測量，因此每條擺線長度很易算出。測格中共有45條擺線，其總長為45d。圖中直角短線（L）示測點(diǎn)，共90個(gè)，測線長度L與測點(diǎn)數(shù)P的關(guān)聯(lián)關(guān)系為L=d/2P。具體來說，用圖97擺線測格，置于一個(gè)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)照片上，如果整個(gè)測格均位于照片內(nèi)，則參照面內(nèi)測線總長度為45d,如果90個(gè)測點(diǎn)只有60個(gè)落至細(xì)胞內(nèi)（即測格中有30個(gè)測點(diǎn)落在此照片外）則參照面內(nèi)的測線總長度為d/2P=d/260=30d。擺線與特征物（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、線粒體的膜等）的交叉點(diǎn)容易數(shù)，用上述IL和SV公式即可得出所需參數(shù)。此公式為經(jīng)過數(shù)學(xué)上的研究而得出，我們可應(yīng)用公式來作表面積密度的研究。　　讀者需注意的是：若特征物是各向同性分布，可采用任意方向的隨機(jī)切片。若特征物呈各向異性分布，可采用垂直切片或其他一些方法制作的切片。Mattfeldt等曾提出在一個(gè)組織塊中作三個(gè)互相垂直的切片（three mutually perpendiculer sections ）用作研究。目前通用的垂直切片的概念是1986年Baddeley等人提出，指垂直于某任意確定的水平面的隨機(jī)切片，或平行于某一任意確定的垂直軸的隨機(jī)切片。如圖98所示，HP為水平面（horizontal plane），VP為垂直面（vertical planes），二個(gè)垂直面互相不是平行關(guān)系，成一定角度。在生物組織中，如皮膚的表皮、各種上皮的外表面均可作為水平面，只要與水平面垂直的各個(gè)方向所切的切片均為垂直切片。骨骼肌纖維的長