【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ② 正常基因堿基序列（ N） 雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果： M+ N 受檢者是突變基因的純合子 M N+ 受檢者是不存在突變基因 M N 受檢者的缺陷基因可能是一種新的突變類型 M+ N+ 受檢者是突變基因的雜合子 原理： 已知基因突變部位和性質(zhì)，合成基因特異的核苷酸探針（ 20bp），標(biāo)記后與受檢者 DNA雜交診斷。（可與 PCR聯(lián)用： PCRASO） 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（ SSCP） 日本 Orita等研究發(fā)現(xiàn)，單鏈 DNA片段呈復(fù)雜的 空間折疊構(gòu)象，當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)或 多或 少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變， 空間構(gòu)象有差異的單鏈 DNA分子在聚丙烯酰胺 凝膠中受排阻大小不同 .因此，通過 非變性聚丙 烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)， 可以非常 敏銳地將構(gòu) 象上有差異的分子分離開 . PCRSSCP PCRSSCP基本過程 ① PCR擴(kuò)增靶 DNA ② 將特異的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后快速?gòu)?fù)性 。 ③ 將單 鏈 DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 。 ④ 通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯 色分析結(jié)果 .若發(fā)現(xiàn)單鏈 DNA帶遷移率與正常對(duì)照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該 DNA片段中有堿基突變 . 基因芯片 將指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)根據(jù)雜交分子和未雜交分子信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。 基本原理： （生物集成模片、 DNA陣列、或寡核苷酸微芯片） 基因芯片技術(shù)： 目的：檢測(cè)外源性基因的侵入 目標(biāo)： 微生物 病毒 如： HIV（致艾滋病 AIDS） 寄生蟲、 不易體外培養(yǎng)的病原體（毒性大腸桿菌、麻風(fēng)分枝 桿菌） 實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的病原體（克立氏體） 四、基因診斷的 臨床應(yīng)用 : 在感染性疾病檢測(cè)中應(yīng)用 艾滋病與 HIV病毒 艾滋病由 HIV通過接觸、血液、血制品及母嬰傳播感染所致。 HIV特異地侵犯輔助性 T細(xì)胞（ CD4），引起人體細(xì)胞免疫嚴(yán)重缺陷，導(dǎo)致頑固的機(jī)會(huì)性感染，惡性腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)損傷。 HIV 感染后， 95%感染者 5個(gè)月可檢出抗體（也有 34年仍不能檢出抗體）。有必要進(jìn)行PCR技術(shù)檢測(cè)。 艾滋病與 HIV病毒 檢測(cè)技術(shù)： 巢式 PCR、 Southern、 DNA序列分析 引物的設(shè)計(jì) ：應(yīng)在保守區(qū)（基因： pol, env, gag, tat) 病毒特點(diǎn)： HIV病毒由兩條單鏈 RNA組成， / RNA， 主要基因結(jié)構(gòu)和組成形成與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相同，但較 之復(fù)雜，故稱復(fù)雜反轉(zhuǎn)錄病毒 HIV屬反轉(zhuǎn)錄病毒－－－即單鏈 RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈 DNA， 進(jìn)入宿主細(xì)胞染色體。 非典型性肺炎（ SARS） 由一種新型冠狀病毒（ SARSCoV）引起，多種 途徑傳播，傳染性強(qiáng)、高致死率的急性疾病。 診斷依靠： 流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、放射診斷、 血清學(xué)（熒光免疫、 ELISA） PCR作為一種靈敏的早期病原學(xué)診斷必不可少 （關(guān)鍵是引物的合成） 在遺傳病檢測(cè)中的應(yīng)用 ? 產(chǎn)前診斷 檢測(cè)妊娠 8－ 12周的絨毛 DNA或羊水細(xì)胞 PCR診斷一系列遺傳疾病 ? 鐮刀狀細(xì)胞貧血的診斷 方法：－ RFLP診斷 MstⅡ 酶切識(shí)別序列： CCTNAGG 切割正常 β 鏈序列： CCTGAGG 不切割突變序列： CCTGTGG － ASO探針診斷 在腫瘤檢測(cè)中的應(yīng)用 原癌基因 生物正常細(xì)胞基因中編碼關(guān)鍵性調(diào)控蛋白的 癌基因 抑癌基因 一類抑制細(xì)胞增殖的基因，其失活可引起細(xì) 胞轉(zhuǎn)化。 兩類基因協(xié)同調(diào)控，使細(xì)胞生長(zhǎng)處于平衡狀態(tài)。 癌基因激活變化及檢測(cè)： 基因擴(kuò)增：即染色體某區(qū)段基因拷貝數(shù)增加，或癌基 因的擴(kuò)增。 檢測(cè)方法： Southern 雜交 定量 PCR 基因的過量表達(dá)：包括基因擴(kuò)增基礎(chǔ)上的過量表達(dá)及非 DNA水平的過量表達(dá)。 檢測(cè)方法： Northern 雜交 RTPCR 點(diǎn)突變： 檢測(cè)方法為各種基于 PCR的方法。 抑癌基因的檢測(cè)： Southern PCR 大片段的缺失、和點(diǎn)突變 *兩個(gè)等位抑癌基因突變才能引起腫瘤，需檢 出兩個(gè)等位抑癌基因。 方法： RFLP結(jié)合 PCR，進(jìn)行缺失檢測(cè) 點(diǎn)突變主要采用 PCR 腫瘤標(biāo)志物： 指特征性存在于惡性腫瘤或由惡性腫瘤細(xì) 胞異常產(chǎn)生的物質(zhì)或宿主對(duì)腫瘤反應(yīng)而產(chǎn) 生的物質(zhì)。 （ 1）酶類腫瘤標(biāo)志物 （ 2）激素類標(biāo)志物 （ 3）胚胎抗原 （ 4）特殊蛋白標(biāo)志物 （ 5）糖蛋白類抗原 （ 6）血中癌基因蛋白 （ 7）唾液酸和唾液酸?；D(zhuǎn)移酶 （ 8）多胺 免疫組化篩選提高檢出率 法醫(yī)學(xué)鑒定 針對(duì)人類 DNA 遺傳差異進(jìn)行的個(gè)體識(shí)別和親子鑒定。 常用技術(shù) : DNA指紋分析（ VNTR） 短串聯(lián)重復(fù)序列（ STR）遺傳特征分析 PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（ AmPFLP) PCRmtDNA技術(shù) 根據(jù) 可變串