【文章內(nèi)容簡介】 OD N A : X = HR N A : X = O HB = A de , T hy , G ua , C y t…… …… OHO HHO HHH堿基OH2 COPOPOPOOOO O O 核苷酸 （ RNA 單體）O O HHHHO HHHHOH 2 C O O HHO HHO HHHHOH 2 C2 脫氫 β D 核糖在 DNA 中β D 核糖在 RNA 中OHHHO HHH堿基OH2 COPOPOPOOOO O O 脫氧核苷酸 deo xy nucle o tide (DNA 單體 )2. 核酸中的氫鍵與疏水鍵 ? 氫鍵在核酸的三維結(jié)構(gòu)中是處于重要地位的，這些鍵位于分開的聚核苷酸鍵之間或是在同一個鍵的不同部位之間。由氫鍵連起來的一對堿基常常帶有一個嘌呤和一個嘧啶，往往是腺嘌呤與胸腺嘧啶或尿嘧啶相結(jié)合（ AT或 AU）。若是鳥嘌呤則常常與胞嘧啶相結(jié)合（ GC）。在某些特殊情況下，氫鍵可以連系三個堿基。 ? 在核酸的結(jié)構(gòu)中疏水鍵也很重要。雜環(huán)堿基是疏水性的，他們彼此間可能結(jié)合在一起，而不是與水結(jié)合。在分子的雙鏈段區(qū)內(nèi)，堿基可以相互平行排列，彼此在分子內(nèi)部一個堆積在另一個的頂部連接起來。平行的雜環(huán)堿基中介電子彼此相互作用使疏水性增強。 3. 核酸中 DNA和 RNA結(jié)構(gòu)及其性質(zhì) ? DNA分子是由帶有雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩支多核苷鏈所構(gòu)成，這兩只鏈向著相反方向發(fā)展，它們以氫鍵的方式使堿基成對結(jié)合。 DNA兩條鏈中的堿基并不相同，但卻能互補，其中一條鏈中的堿基的順序就能決定另一條鏈中堿基的順序， AT結(jié)合， GC結(jié)合，如： 5’端 GATCACGTA3’端 3’端 CTAGTGCAT5’端 poly I (肌苷酸 ) － poly C (胞嘧啶核苷酸 ) 1 ： 1的雙鏈聚合物 聚肌胞 中國， 1979年，通過鑒定 poly I poly C 其二次結(jié)構(gòu)對活性影響甚大，僅有雙鏈結(jié)構(gòu)聚合物才有活性 NNN H 2O OOnO HO PO HOPOO HOOmNNNN HOO H4. 核酸的功能 ? 生物體的基因信息存在于細胞的脫氧核糖核酸的堿基順序中作為密碼。較高級的生物體中，大部分的DNA都存在于細胞核的染色體內(nèi)，少量則存在于細胞顆粒中，即存在于線粒體與葉綠體中。線粒體可發(fā)出能量，葉綠體則是光合作用的反應(yīng)點。 ? （ 1） 信息的再生 —復(fù)制 ? （ 2） 信息的揭示 —轉(zhuǎn)錄 基因再組合 遺傳密碼表和用 20種氨基酸有里往外的太陽式圖 二、 PCR擴增技術(shù) 實驗原理 ?多聚酶鏈反應(yīng)（ PCR）技術(shù)的原理類似于DNA的天然復(fù)制過程?？珊喪鰹椋? ?在微量離心管中加入適量緩沖液，加入微量模板 DNA，四種脫氧核苷酸（ dNTP），和耐熱 Taq聚合酶及兩個合成的 DNA引物，并有 Mg2+存在。 實驗原理 ? 加熱使模板 DNA在高溫下（ 94℃ ）變性，雙鏈解鏈，這是所謂變性階段。 ? 降低溶液溫度，使合成引物在低溫（ 56℃ ）與模板DNA互補退火形成部分雙鏈，這是所謂退火階段。 ? 溶液反應(yīng)溫度升至中溫（ 72℃ ），在 Taq酶作用下，以四種 dNTP為原料，引物為復(fù)制起點，模板 DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。 ? 如此反復(fù)，在同一反應(yīng)體系中可重復(fù)高溫變性、低溫復(fù)性和 DNA合成這一循環(huán)，使產(chǎn)物 DNA重復(fù)合成，并且在重復(fù)過程中，前一循環(huán)的產(chǎn)物 DNA可作為后一循環(huán)的模板 DNA而參與 DNA的合成，使產(chǎn)物 DNA的量按 2n方式擴增。經(jīng)過 25～ 35個循環(huán)， DNA擴增倍數(shù)可達106～ 109。 實驗原理 基因組 DNA提取原 理 DNA在生物體內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在的。核酸與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合力包括離子鍵、氫鍵、范德華力等，破壞或降低這些結(jié)合力就可把核酸與蛋白分開。 DNA、 RNA所含有的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵具有吸收紫外光的性質(zhì)，吸收高峰在 260nm處，所以，可用紫外分光光度法測定 DNA的濃度。 5. 標記化合物的方法及其應(yīng)用 ? 同位素的靈敏度非常高，所以可以用合成方法使被研究的物質(zhì)分子含有穩(wěn)定同位素或放射性同位素作為標記。這種化合物就稱為標記化合物。標記以后，就能很準確的測量這些物質(zhì)的存在，還能測出這些物質(zhì)產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)所述的路徑，即使在生物體內(nèi)也行。這種技術(shù)就稱為 同位素示蹤法（ radioactive tracing）。 ? I. 制備標記化合物的方法： ? 交換法 ? 化學(xué)合成法 ? 生物合成法 ? II. 同位素的測量 ? 同位素的測量使用較精密的測量儀器，如質(zhì)譜儀或核磁共振儀。表示放射性強度的方法有： ? （ 1）比放射性 或稱放射性比度 (specific activity)。這表示單位數(shù)量物質(zhì)的放射性，如說明某一樣品中放射性元素的含量與該元素總量的比例或百分比；例如： ? ? 其次是代表單位重量或單位容量的物質(zhì)衰變率。如 “ 每毫克每分鐘若干次 ” 或 “ 每毫克中若干微居里 ” ， “ 每毫克分子量的毫居里數(shù)。 ” ? （ 2）回收率 這說明某一樣品的放射性與生物體接受的總放射性之比： 給予的放射性樣品的放射性回收率 ?PPP323132??放射性元素的含量? 同位素測量中 ， 因它們的穿透能力不同 ， 可有下列類別： ? （ 1） γ 射線發(fā)射體的測量 ? 發(fā)射 γ 射線的同位素 ， 如 131I、 24Na、 38Cl、 82Br、 51Cr、 65Zn、59Fe等 ， 由于它們有很高的穿透能力 ， 不必經(jīng)過萃取或分離就可以直接測量 。 測量的設(shè)備可用碘化鈉閃爍計數(shù)品 。 ? （ 2） 軟 β 射線測量 ? 如 14C、 3H、 35S、 45Ca等都是低能量 射線的發(fā)射體，在生物高分子中占有很重要的地位。操作過程中，應(yīng)當盡量增大幾何效率，并盡量減少射線在樣品中產(chǎn)生自吸收和被測量儀 器吸收作用。測量時應(yīng)使用薄窗蓋革計數(shù)管或無窗蓋革計數(shù)管。 ? （ 3） 硬 β 射線測量 ? 這些應(yīng)用于能發(fā)射高能 粒子的同位素 ， 如 32P、 131I、 38Cl等 ， 測量時應(yīng)使用底窗型計數(shù)管 。 ? （ 4） 活化分析 ? 活化分析是把原來沒有放射性的樣品經(jīng)中心照射，使其中普通元素變成具有特征射線的產(chǎn)物，而后進行鑒定和測量?；罨治鼍哂懈哽`敏度、高度專一性，而且不損壞樣品。在研究天然高分子方面很適應(yīng)。所需能源可來自反應(yīng)堆，加速器或同位素中子源等。 第三節(jié) 酶的高分子化學(xué) ?酶是最主要的、以蛋白質(zhì)為主的特殊功能高分子 。 ?特點： ? 1. 催化效率高，一般為無機催化劑的 1061013倍。 ? 2. 專一性強，酶對其底物（ substrate）即被作用物有嚴 ? 格的選擇性 ,高度特異性。 ? 3. 反應(yīng)條件溫和，一般在常溫常壓下進行，酶活性的不穩(wěn)定性（容易失活）。 ? 4. 酶的作用是可以調(diào)節(jié)和控制的。 （一） 酶的固定化（ immobilization） ?酶作為催化劑有穩(wěn)定性差的缺點，對熱、強酸、強堿、有機溶劑等均不夠穩(wěn)定，即使在最適條件下，也會很快失活。所以使用酶作為催化劑時，使用固定化方法是必需的。 關(guān)于酶的活力： ? 按 1964年國際生化協(xié)會統(tǒng)一規(guī)定，酶活力等于能使 1181。mol底物在 1min內(nèi)轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的酶量，溫度為 25℃ ，反應(yīng)時 pH值與底物濃度等均采用最適條件。 由于酶很不穩(wěn)定，在提取時易變性失活，因而提取時應(yīng)注意： (])溫度 整個提純操作應(yīng)盡可能在低溫下 (0— 4C)進行，以防止酶的變性失活或蛋白質(zhì)水解酶對目的酶的水解(尤其是在有機溶劑或無機鹽存在下更應(yīng)注意 ) (2)PH 在提純過程中一般采用緩沖液作為溶劑，防止過酸或過堿。對一特定的酶，溶劑 pH的選擇應(yīng)考慮酶的 pH穩(wěn)定性以及酶的溶解度。 (3)鹽濃度 因為大多數(shù)蛋白質(zhì)具有鹽溶性質(zhì)．所以在抽提過程中可選用合適濃度的鹽溶液以促進蛋白質(zhì)溶解；但要注意當鹽濃度過高時，酶容易變性； (4)攪拌 劇烈攪拌容易引起蛋白質(zhì)變性，提純中應(yīng)避免劇烈攪拌和產(chǎn)生泡沫。 (5)微生物污染 酶液是微生物生長的良好培養(yǎng)基，在提純過程中應(yīng)盡可能防止微生物對酶的破壞。 酶的制備流程： 一般包括破碎細胞 、 溶劑抽提 、 離心 、 過濾 、 濃縮 、 干燥這幾個步驟 ， 對某些純度要求很高的酶則需經(jīng)幾種方法乃至多次反復(fù)處理 。 (1)破碎細胞 除了胞外酶的提取以外 ， 所有胞內(nèi)酶均需將細胞破碎后方可進一步抽提 。 破碎細胞有許多方法 ， 動植物細胞常用高速組織搗碎機和組織勻漿器破碎 ， 而微生物細胞的破碎則有機械破碎法 、 酶法 、 化學(xué)試劑法和物理破碎法 等多種 。 (2)溶劑抽提 大多數(shù)酶蛋白都可用稀酸 、 稀堿或稀鹽溶液浸泡抽提 。 何種溶劑和抽提條件視酶的溶解性和穩(wěn)定性而定 ， 抽提時應(yīng)注意溶劑種類 、溶劑量 、 溶劑 pH等的選擇 。 (3)離心分離 離心分離是酶分離提純中最常用的方法 ， 主要用于除去細胞碎片或抽提過程中生成的沉淀物 。 工業(yè)上常用板框壓濾機來完成酶的粗分離 。 (4)濃縮 由于發(fā)酵液或酶抽提液中酶的濃度一般都比較低 ， 必須經(jīng)過進一步純化以便于保存 、 運輸和應(yīng)用 。 事實上 ， 大多數(shù)純化酶的操作如吸附 、 沉淀 、 凝膠過濾等均包含了酶的濃縮作用 ， 工業(yè)上常采用真空薄膜濃縮法以保證酶在濃縮過程中基本不失活 。 (5)干燥 酶溶液或含水量高的酶制劑即使在低溫下也極不穩(wěn)定 ， 只能作短期保存 。 為便于酶制劑的長時間的運輸 、 儲存 ， 防止酶變性 ， 往往需對酶進行干燥 ， 制成含水量較低的制品 。 常用的干燥方法有真空十燥 、 冷凍干燥 、 噴霧干燥等 。 各種酶傳感器的基本結(jié)構(gòu) 固定化方法與實施 (1)物理吸附法 是制備固定化酶最早采用的方法 ， 它是以固體表面物理吸附為依據(jù) ， 使酶與水不溶性載體相接觸而達到酶吸附的目的 。 吸附的載體可以是石英砂 、 多 7孔玻璃 、硅膠 、 淀粉 、 高嶺土 、 活性炭等對蛋白質(zhì)有高度吸附力的吸附劑 。 該方法操作簡單 ， 反應(yīng)條件溫和 ， 反復(fù)使用 ， 但結(jié)合力弱 ． 酶易解析并污染產(chǎn)品 。 (2)離子吸附法 該法是通過離子效應(yīng) ， 將酶分子固定到含有離子交換基團的固相載體上 。 最早應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的氨基酰化酶 ， 就是使用多糖類陰離子交換劑 DEAE — 葡聚糖凝膠固定化的 。 常見的載體有 DEAE— 纖維素 、 CM—衍生物等 。 離子吸附法的操作同樣簡便 ， 反應(yīng)條件溫和 ， 制備出的固定化酶活性高 ， 但載體與酶分子之間的結(jié)合仍不夠牢固 ． 當使用高濃度底物高離子強度或PH發(fā)生變化時酶容易脫落 ． 但這種固定化酶容易回收再生 。 ? (3)螯合法 ?這是一種比較吸引人的技術(shù)，它主要是利用螯合作用將酶直接螯合到表面含過渡金屬化合物的載體上，具有較高的操作穩(wěn)定性。已知能用于酶固定化的金屬氫氧化物有鈦 (二價和四價 )、鐵 (四價 )和釩 (三價 )等，其中以鈦 (四價 )和鐵 (四價 )的氫氧化物較好，它們能與酶的羧基、氨基和羥基結(jié)合。 ? (4)共價結(jié)合法 ?共價結(jié)合法是通過酶分子上的官能團，與載體表面上的反應(yīng)基團發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成共價鍵的一種固定化方法，是研究得最多的固定化方法之一。共價交聯(lián)法是通過雙功能或多功能試劑，在酶分子間或酶分子和載體間形成共價鍵的連接方法。這些具有兩種相向或不同功能基團的試劑叫做交聯(lián)劑。共價交聯(lián)法與共價結(jié)合法一樣，反應(yīng)條件比較激烈，固定化酶的回收率比較低， — 般不單獨使用，但如能降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時間，則固定化酶的比活會有所提高。常見的交聯(lián)劑有順丁烯二酸酐和乙烯共聚物、戊二醛等，其中以戊二醛最為常用。 （ 5） 包埋法 ? 將酶包埋在高聚物凝膠網(wǎng)格中或高分子半透膜內(nèi)的固定方法。前者又稱為凝膠包埋法，后者則稱為微囊法。 ?包埋法一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基起結(jié)合反