【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 OD N A : X = HR N A : X = O HB = A de , T hy , G ua , C y t…… …… OHO HHO HHH堿基OH2 COPOPOPOOOO O O 核苷酸 （ RNA 單體）O O HHHHO HHHHOH 2 C O O HHO HHO HHHHOH 2 C2 脫氫 β D 核糖在 DNA 中β D 核糖在 RNA 中OHHHO HHH堿基OH2 COPOPOPOOOO O O 脫氧核苷酸 deo xy nucle o tide (DNA 單體 )2. 核酸中的氫鍵與疏水鍵 ? 氫鍵在核酸的三維結(jié)構(gòu)中是處于重要地位的，這些鍵位于分開(kāi)的聚核苷酸鍵之間或是在同一個(gè)鍵的不同部位之間。由氫鍵連起來(lái)的一對(duì)堿基常常帶有一個(gè)嘌呤和一個(gè)嘧啶，往往是腺嘌呤與胸腺嘧啶或尿嘧啶相結(jié)合（ AT或 AU）。若是鳥(niǎo)嘌呤則常常與胞嘧啶相結(jié)合（ GC）。在某些特殊情況下，氫鍵可以連系三個(gè)堿基。 ? 在核酸的結(jié)構(gòu)中疏水鍵也很重要。雜環(huán)堿基是疏水性的，他們彼此間可能結(jié)合在一起，而不是與水結(jié)合。在分子的雙鏈段區(qū)內(nèi)，堿基可以相互平行排列，彼此在分子內(nèi)部一個(gè)堆積在另一個(gè)的頂部連接起來(lái)。平行的雜環(huán)堿基中介電子彼此相互作用使疏水性增強(qiáng)。 3. 核酸中 DNA和 RNA結(jié)構(gòu)及其性質(zhì) ? DNA分子是由帶有雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩支多核苷鏈所構(gòu)成，這兩只鏈向著相反方向發(fā)展，它們以氫鍵的方式使堿基成對(duì)結(jié)合。 DNA兩條鏈中的堿基并不相同，但卻能互補(bǔ)，其中一條鏈中的堿基的順序就能決定另一條鏈中堿基的順序， AT結(jié)合， GC結(jié)合，如： 5’端 GATCACGTA3’端 3’端 CTAGTGCAT5’端 poly I (肌苷酸 ) － poly C (胞嘧啶核苷酸 ) 1 ： 1的雙鏈聚合物 聚肌胞 中國(guó)， 1979年，通過(guò)鑒定 poly I poly C 其二次結(jié)構(gòu)對(duì)活性影響甚大，僅有雙鏈結(jié)構(gòu)聚合物才有活性 NNN H 2O OOnO HO PO HOPOO HOOmNNNN HOO H4. 核酸的功能 ? 生物體的基因信息存在于細(xì)胞的脫氧核糖核酸的堿基順序中作為密碼。較高級(jí)的生物體中，大部分的DNA都存在于細(xì)胞核的染色體內(nèi)，少量則存在于細(xì)胞顆粒中，即存在于線粒體與葉綠體中。線粒體可發(fā)出能量，葉綠體則是光合作用的反應(yīng)點(diǎn)。 ? （ 1） 信息的再生 —復(fù)制 ? （ 2） 信息的揭示 —轉(zhuǎn)錄 基因再組合 遺傳密碼表和用 20種氨基酸有里往外的太陽(yáng)式圖 二、 PCR擴(kuò)增技術(shù) 實(shí)驗(yàn)原理 ?多聚酶鏈反應(yīng)（ PCR）技術(shù)的原理類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程?？珊?jiǎn)述為： ?在微量離心管中加入適量緩沖液，加入微量模板 DNA，四種脫氧核苷酸（ dNTP），和耐熱 Taq聚合酶及兩個(gè)合成的 DNA引物，并有 Mg2+存在。 實(shí)驗(yàn)原理 ? 加熱使模板 DNA在高溫下（ 94℃ ）變性，雙鏈解鏈，這是所謂變性階段。 ? 降低溶液溫度，使合成引物在低溫（ 56℃ ）與模板DNA互補(bǔ)退火形成部分雙鏈，這是所謂退火階段。 ? 溶液反應(yīng)溫度升至中溫（ 72℃ ），在 Taq酶作用下，以四種 dNTP為原料，引物為復(fù)制起點(diǎn)，模板 DNA的一條雙鏈在解鏈和退火之后延伸為兩條雙鏈，這是延伸階段。 ? 如此反復(fù)，在同一反應(yīng)體系中可重復(fù)高溫變性、低溫復(fù)性和 DNA合成這一循環(huán)，使產(chǎn)物 DNA重復(fù)合成，并且在重復(fù)過(guò)程中，前一循環(huán)的產(chǎn)物 DNA可作為后一循環(huán)的模板 DNA而參與 DNA的合成，使產(chǎn)物 DNA的量按 2n方式擴(kuò)增。經(jīng)過(guò) 25～ 35個(gè)循環(huán)， DNA擴(kuò)增倍數(shù)可達(dá)106～ 109。 實(shí)驗(yàn)原理 基因組 DNA提取原 理 DNA在生物體內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在的。核酸與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合力包括離子鍵、氫鍵、范德華力等，破壞或降低這些結(jié)合力就可把核酸與蛋白分開(kāi)。 DNA、 RNA所含有的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵具有吸收紫外光的性質(zhì)，吸收高峰在 260nm處，所以，可用紫外分光光度法測(cè)定 DNA的濃度。 5. 標(biāo)記化合物的方法及其應(yīng)用 ? 同位素的靈敏度非常高，所以可以用合成方法使被研究的物質(zhì)分子含有穩(wěn)定同位素或放射性同位素作為標(biāo)記。這種化合物就稱(chēng)為標(biāo)記化合物。標(biāo)記以后，就能很準(zhǔn)確的測(cè)量這些物質(zhì)的存在，還能測(cè)出這些物質(zhì)產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)所述的路徑，即使在生物體內(nèi)也行。這種技術(shù)就稱(chēng)為 同位素示蹤法（ radioactive tracing）。 ? I. 制備標(biāo)記化合物的方法： ? 交換法 ? 化學(xué)合成法 ? 生物合成法 ? II. 同位素的測(cè)量 ? 同位素的測(cè)量使用較精密的測(cè)量?jī)x器，如質(zhì)譜儀或核磁共振儀。表示放射性強(qiáng)度的方法有： ? （ 1）比放射性 或稱(chēng)放射性比度 (specific activity)。這表示單位數(shù)量物質(zhì)的放射性，如說(shuō)明某一樣品中放射性元素的含量與該元素總量的比例或百分比；例如： ? ? 其次是代表單位重量或單位容量的物質(zhì)衰變率。如 “ 每毫克每分鐘若干次 ” 或 “ 每毫克中若干微居里 ” ， “ 每毫克分子量的毫居里數(shù)。 ” ? （ 2）回收率 這說(shuō)明某一樣品的放射性與生物體接受的總放射性之比： 給予的放射性樣品的放射性回收率 ?PPP323132??放射性元素的含量? 同位素測(cè)量中 ， 因它們的穿透能力不同 ， 可有下列類(lèi)別： ? （ 1） γ 射線發(fā)射體的測(cè)量 ? 發(fā)射 γ 射線的同位素 ， 如 131I、 24Na、 38Cl、 82Br、 51Cr、 65Zn、59Fe等 ， 由于它們有很高的穿透能力 ， 不必經(jīng)過(guò)萃取或分離就可以直接測(cè)量 。 測(cè)量的設(shè)備可用碘化鈉閃爍計(jì)數(shù)品 。 ? （ 2） 軟 β 射線測(cè)量 ? 如 14C、 3H、 35S、 45Ca等都是低能量 射線的發(fā)射體，在生物高分子中占有很重要的地位。操作過(guò)程中，應(yīng)當(dāng)盡量增大幾何效率，并盡量減少射線在樣品中產(chǎn)生自吸收和被測(cè)量?jī)x 器吸收作用。測(cè)量時(shí)應(yīng)使用薄窗蓋革計(jì)數(shù)管或無(wú)窗蓋革計(jì)數(shù)管。 ? （ 3） 硬 β 射線測(cè)量 ? 這些應(yīng)用于能發(fā)射高能 粒子的同位素 ， 如 32P、 131I、 38Cl等 ， 測(cè)量時(shí)應(yīng)使用底窗型計(jì)數(shù)管 。 ? （ 4） 活化分析 ? 活化分析是把原來(lái)沒(méi)有放射性的樣品經(jīng)中心照射，使其中普通元素變成具有特征射線的產(chǎn)物，而后進(jìn)行鑒定和測(cè)量?；罨治鼍哂懈哽`敏度、高度專(zhuān)一性，而且不損壞樣品。在研究天然高分子方面很適應(yīng)。所需能源可來(lái)自反應(yīng)堆，加速器或同位素中子源等。 第三節(jié) 酶的高分子化學(xué) ?酶是最主要的、以蛋白質(zhì)為主的特殊功能高分子 。 ?特點(diǎn)： ? 1. 催化效率高，一般為無(wú)機(jī)催化劑的 1061013倍。 ? 2. 專(zhuān)一性強(qiáng)，酶對(duì)其底物（ substrate）即被作用物有嚴(yán) ? 格的選擇性 ,高度特異性。 ? 3. 反應(yīng)條件溫和，一般在常溫常壓下進(jìn)行，酶活性的不穩(wěn)定性（容易失活）。 ? 4. 酶的作用是可以調(diào)節(jié)和控制的。 （一） 酶的固定化（ immobilization） ?酶作為催化劑有穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)，對(duì)熱、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑等均不夠穩(wěn)定，即使在最適條件下，也會(huì)很快失活。所以使用酶作為催化劑時(shí)，使用固定化方法是必需的。 關(guān)于酶的活力： ? 按 1964年國(guó)際生化協(xié)會(huì)統(tǒng)一規(guī)定，酶活力等于能使 1181。mol底物在 1min內(nèi)轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物的酶量，溫度為 25℃ ，反應(yīng)時(shí) pH值與底物濃度等均采用最適條件。 由于酶很不穩(wěn)定，在提取時(shí)易變性失活，因而提取時(shí)應(yīng)注意： (])溫度 整個(gè)提純操作應(yīng)盡可能在低溫下 (0— 4C)進(jìn)行，以防止酶的變性失活或蛋白質(zhì)水解酶對(duì)目的酶的水解(尤其是在有機(jī)溶劑或無(wú)機(jī)鹽存在下更應(yīng)注意 ) (2)PH 在提純過(guò)程中一般采用緩沖液作為溶劑，防止過(guò)酸或過(guò)堿。對(duì)一特定的酶，溶劑 pH的選擇應(yīng)考慮酶的 pH穩(wěn)定性以及酶的溶解度。 (3)鹽濃度 因?yàn)榇蠖鄶?shù)蛋白質(zhì)具有鹽溶性質(zhì)．所以在抽提過(guò)程中可選用合適濃度的鹽溶液以促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解；但要注意當(dāng)鹽濃度過(guò)高時(shí)，酶容易變性； (4)攪拌 劇烈攪拌容易引起蛋白質(zhì)變性，提純中應(yīng)避免劇烈攪拌和產(chǎn)生泡沫。 (5)微生物污染 酶液是微生物生長(zhǎng)的良好培養(yǎng)基，在提純過(guò)程中應(yīng)盡可能防止微生物對(duì)酶的破壞。 酶的制備流程： 一般包括破碎細(xì)胞 、 溶劑抽提 、 離心 、 過(guò)濾 、 濃縮 、 干燥這幾個(gè)步驟 ， 對(duì)某些純度要求很高的酶則需經(jīng)幾種方法乃至多次反復(fù)處理 。 (1)破碎細(xì)胞 除了胞外酶的提取以外 ， 所有胞內(nèi)酶均需將細(xì)胞破碎后方可進(jìn)一步抽提 。 破碎細(xì)胞有許多方法 ， 動(dòng)植物細(xì)胞常用高速組織搗碎機(jī)和組織勻漿器破碎 ， 而微生物細(xì)胞的破碎則有機(jī)械破碎法 、 酶法 、 化學(xué)試劑法和物理破碎法 等多種 。 (2)溶劑抽提 大多數(shù)酶蛋白都可用稀酸 、 稀堿或稀鹽溶液浸泡抽提 。 何種溶劑和抽提條件視酶的溶解性和穩(wěn)定性而定 ， 抽提時(shí)應(yīng)注意溶劑種類(lèi) 、溶劑量 、 溶劑 pH等的選擇 。 (3)離心分離 離心分離是酶分離提純中最常用的方法 ， 主要用于除去細(xì)胞碎片或抽提過(guò)程中生成的沉淀物 。 工業(yè)上常用板框壓濾機(jī)來(lái)完成酶的粗分離 。 (4)濃縮 由于發(fā)酵液或酶抽提液中酶的濃度一般都比較低 ， 必須經(jīng)過(guò)進(jìn)一步純化以便于保存 、 運(yùn)輸和應(yīng)用 。 事實(shí)上 ， 大多數(shù)純化酶的操作如吸附 、 沉淀 、 凝膠過(guò)濾等均包含了酶的濃縮作用 ， 工業(yè)上常采用真空薄膜濃縮法以保證酶在濃縮過(guò)程中基本不失活 。 (5)干燥 酶溶液或含水量高的酶制劑即使在低溫下也極不穩(wěn)定 ， 只能作短期保存 。 為便于酶制劑的長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)輸 、 儲(chǔ)存 ， 防止酶變性 ， 往往需對(duì)酶進(jìn)行干燥 ， 制成含水量較低的制品 。 常用的干燥方法有真空十燥 、 冷凍干燥 、 噴霧干燥等 。 各種酶?jìng)鞲衅鞯幕窘Y(jié)構(gòu) 固定化方法與實(shí)施 (1)物理吸附法 是制備固定化酶最早采用的方法 ， 它是以固體表面物理吸附為依據(jù) ， 使酶與水不溶性載體相接觸而達(dá)到酶吸附的目的 。 吸附的載體可以是石英砂 、 多 7孔玻璃 、硅膠 、 淀粉 、 高嶺土 、 活性炭等對(duì)蛋白質(zhì)有高度吸附力的吸附劑 。 該方法操作簡(jiǎn)單 ， 反應(yīng)條件溫和 ， 反復(fù)使用 ， 但結(jié)合力弱 ． 酶易解析并污染產(chǎn)品 。 (2)離子吸附法 該法是通過(guò)離子效應(yīng) ， 將酶分子固定到含有離子交換基團(tuán)的固相載體上 。 最早應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的氨基酰化酶 ， 就是使用多糖類(lèi)陰離子交換劑 DEAE — 葡聚糖凝膠固定化的 。 常見(jiàn)的載體有 DEAE— 纖維素 、 CM—衍生物等 。 離子吸附法的操作同樣簡(jiǎn)便 ， 反應(yīng)條件溫和 ， 制備出的固定化酶活性高 ， 但載體與酶分子之間的結(jié)合仍不夠牢固 ． 當(dāng)使用高濃度底物高離子強(qiáng)度或PH發(fā)生變化時(shí)酶容易脫落 ． 但這種固定化酶容易回收再生 。 ? (3)螯合法 ?這是一種比較吸引人的技術(shù)，它主要是利用螯合作用將酶直接螯合到表面含過(guò)渡金屬化合物的載體上，具有較高的操作穩(wěn)定性。已知能用于酶固定化的金屬氫氧化物有鈦 (二價(jià)和四價(jià) )、鐵 (四價(jià) )和釩 (三價(jià) )等，其中以鈦 (四價(jià) )和鐵 (四價(jià) )的氫氧化物較好，它們能與酶的羧基、氨基和羥基結(jié)合。 ? (4)共價(jià)結(jié)合法 ?共價(jià)結(jié)合法是通過(guò)酶分子上的官能團(tuán)，與載體表面上的反應(yīng)基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)鍵的一種固定化方法，是研究得最多的固定化方法之一。共價(jià)交聯(lián)法是通過(guò)雙功能或多功能試劑，在酶分子間或酶分子和載體間形成共價(jià)鍵的連接方法。這些具有兩種相向或不同功能基團(tuán)的試劑叫做交聯(lián)劑。共價(jià)交聯(lián)法與共價(jià)結(jié)合法一樣，反應(yīng)條件比較激烈，固定化酶的回收率比較低， — 般不單獨(dú)使用，但如能降低交聯(lián)劑濃度和縮短反應(yīng)時(shí)間，則固定化酶的比活會(huì)有所提高。常見(jiàn)的交聯(lián)劑有順丁烯二酸酐和乙烯共聚物、戊二醛等，其中以戊二醛最為常用。 （ 5） 包埋法 ? 將酶包埋在高聚物凝膠網(wǎng)格中或高分子半透膜內(nèi)的固定方法。前者又稱(chēng)為凝膠包埋法，后者則稱(chēng)為微囊法。 ?包埋法一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基起結(jié)合反