【文章內(nèi)容簡介】 隆位點區(qū)的兩側(cè)，故若在反應(yīng)試管中加入純化的 T7或SP6 RNA聚合酶，所克隆的外源基因便會轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的 mRNA。 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 53 大腸桿菌 釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體 含有兩種分別來自大腸桿菌和釀酒酵母的復(fù)制起點與選擇標(biāo)記。它使研究工作者可以自如地在這兩種不同的寄主細(xì)胞之間來回轉(zhuǎn)移基因，并單獨或同時在兩種寄主細(xì)胞中研究目的基因的表達(dá)活性及其它調(diào)節(jié)功能。例如，可將酵母的某種基因亞克隆到穿梭質(zhì)粒載體上，置于大腸桿菌中進(jìn)行定點突變處理后，再把突變體基因返回到酵母細(xì)胞，以便在天然寄主中觀察研究此種突變的功能效應(yīng)。 Y Rp 12 (6 .9 k b )o r iTcrE EP B 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 54 噬菌體或病毒 DNA 噬菌體或病毒是一類非細(xì)胞微生物，能高效特異性地轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定條件下上述兩種狀還會相互轉(zhuǎn)化。 λ噬菌體（ 20面體型） 噬菌體 M13（線狀體型） 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 55 噬菌體 ◆ λ 噬菌體基因組全長 49kb。 λ 噬菌體 DNA中間約三分之二的序列為中間基因簇 (central gene cluster)，位于兩端的為 DNA左、右臂。 λ 基因組的中間基因簇序列可被外源 DNA片段取代 , 而不影響噬菌體感染細(xì)菌及形成噬菌斑的能力。 ◆ λ 噬菌體載體可接受 15 kb23 kb的外源 DNA片段，它既可作為克隆載體，也可作為表達(dá)載體，在基因庫篩選中，λ 噬菌體作載體與細(xì)菌質(zhì)粒相比，具有易操作、陽性克隆數(shù)多等特點，現(xiàn)廣泛用于各類基因庫的構(gòu)建。 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 56 噬菌體的生命周期 溶菌周期 ： 是指噬菌體吸附到寄主細(xì)胞表面后，注入 DNA進(jìn)行復(fù)制及蛋白質(zhì)的合成，并組裝成子代噬菌體顆粒，最后使寄主細(xì)胞破裂，釋放出子代噬菌體顆粒。 溶原周期 ： 是指在感染過程中沒有產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，噬菌體 DNA是整合到寄主細(xì)胞染色體 DNA上，成為它的一個組成部分。 DNA重組技術(shù)一般要使噬菌體進(jìn)入溶菌周期 。 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 57 λ DNA載體的構(gòu)建 野生型 λDNA包裝的上限為 51kb，本身長度為 ， 只有當(dāng)插入的外源DNA片段不大于 ，才能包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型 λDNA的長度，可以提高其裝載量。其實野生型 λDNA上約有 4050%的片段是復(fù)制和裂解所必需的， 要據(jù)切除的多少，可分為 插入型載體 和 取代型載體 兩大類。 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 58 插入型載體 免疫失活型 imm434基因編碼一種阻止 λ噬菌進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記的基因 λ載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾濁斑；當(dāng)外源 DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅活， λ重組分子進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成透明斑。 β半乳糖苷酶失活型 LacZ基因編碼 β半乳糖苷酶，能催化無色的 Xgal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基因插入到 LacZ基因中，基因滅活，不能生成藍(lán)色化合物，而空載體裁 λDNA則產(chǎn)生藍(lán)色透明斑。 59 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 替換型載體中具有可取代的 EcoRI片段，內(nèi)編碼有SupE基因。這個噬菌體能校正寄主細(xì)胞的 LacZ基因的琥珀突變。由于這種噬菌體的感染，寄主細(xì)胞LacZ基因的琥珀突變被抑制，所以能在乳糖麥康基氏瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生紅色的噬菌斑，或是在 Xga1瓊脂培基上產(chǎn)生藍(lán)色的噬菌斑。但如果具有SupE基因的 EcoRI片段被外源 DNA所取代，那么形成的重組體噬菌體在上述的兩種指示培養(yǎng)基中都只能產(chǎn)生出無色的噬菌斑。 取代型載體 60 Cosmid質(zhì)粒 黏性質(zhì)粒 （ Cosmid）： 一種用基因工程技術(shù)組建的特殊的大腸桿菌質(zhì)粒，包含噬菌體的 Cos位點和整個 質(zhì)粒的 DNA順序。 ? 抗藥性標(biāo)記 ? 復(fù)制原點 ? 限制性內(nèi)切酶酶位點 ? Cos位點 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 61 ◆ 柯斯質(zhì)粒 (cosmid)是利用部分 λ 噬菌體 DNA與部分細(xì)菌質(zhì)粒 DNA序列組建而成的?？滤官|(zhì)粒具有 λ 噬菌體的 cos序列 (12bp) 和細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點。 cos序列是噬菌體 DNA包裝成噬菌體時所必需的，而質(zhì)粒的復(fù)制原點可使柯斯質(zhì)粒在細(xì)菌細(xì)胞中同普通細(xì)菌質(zhì)粒一樣自主復(fù)制?？滤官|(zhì)粒也具有抗生素抗性基因 ◆可接受長達(dá) 50kb的外源 DNA片段，這在克隆真核生物基因中十分有用，因為一個 DNA片段就可能具有真核生物基因的編碼序列及其它調(diào)控序列。還與 YAC克隆系統(tǒng)結(jié)合，用于基因作圖分析。 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 62 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 用限制性內(nèi)切酶處理質(zhì)粒和噬菌體，再將 cos位點拼接到質(zhì)粒上 再酶切位點將重組質(zhì)粒線形化，再插入相應(yīng) 的基因組 DNA 通過含有氨芐青霉素的選擇性培 養(yǎng)平板篩選 存活的細(xì)胞可能含有相應(yīng) 的重組質(zhì)粒 63 應(yīng)用 Cosmid作載體 進(jìn)行基因克隆的一般程序 穿梭載體 (shuttle vectors )是指能在兩種不同的生物中復(fù)制的載體。例如 既能在原核生物 (如大腸桿菌 )中復(fù)制，又能在真核細(xì)胞 (如酵母 )中復(fù)制的載體。因此，這類載體不僅具有細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制原點及選擇標(biāo)記基因，還有真核生物的自主復(fù)制序列 (Autonomously replicating sequence, ARS)以及選擇標(biāo)記性狀，具有多克隆位點。通常穿梭載體在細(xì)菌中用于克隆、擴(kuò)增克隆的基因，在酵母菌中用于基因表達(dá)分析。 穿梭載體 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 64 BAC載體是基于細(xì)菌的 性因子 (F因子 )質(zhì)粒的一些特點構(gòu)建的。 F因子是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)能自我復(fù)制的質(zhì)粒，約 100kb，它能在細(xì)菌接合時轉(zhuǎn)移 1000kb的細(xì)菌染色體片段。將 F因子經(jīng)基因工程改良構(gòu)成的 BAC載體，可用于克隆 100 kb以上的 DNA片段。 帶有外源片段的 BAC載體在細(xì)菌細(xì)胞中通常僅單個拷貝，這一特點有利于保持 DNA大分子，尤其是重復(fù)序列多的DNA大分子，在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定復(fù)制而不發(fā)生重組。 BAC載體本身分子量小 ，如由小 F質(zhì)粒構(gòu)建的載體 pBeloBAC11全長，僅帶有自我復(fù)制、控制拷貝數(shù) (repE)及質(zhì)粒分配(par E， par A, par B )所必須的最少序列。 BAC載體還具有氯霉素抗性選擇基因及多克隆位點。 在多克隆位點兩側(cè)，還有 T7及 SP6啟動子位點，用于制備 RNA分子，進(jìn)一步分析克隆的基因表達(dá)，作為染色體步行的探針，以及序列測定克隆的片段。 細(xì)菌人工染色體 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 65 酵母人工染色體 酵母人工染色體（ yeast artificial chromosome， YAC）是另一類酵母穿梭載體。同YEp載體一樣具有自主復(fù)制序列、克隆位點以及可在細(xì)菌和酵母菌中選擇的標(biāo)記基因。 YAC還具有酵母菌染色體的一些特點。 YAC可以接受 1001000 kb的外源 DNA片段，這一特點使YAC成為人類基因組計劃及圖位克隆分離基因的重要工具，并促進(jìn)了發(fā)展人類人工染色體(human artificial chromosome， HAC)的研究。 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 66 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 為了使克隆基因獲得正確表達(dá)，轉(zhuǎn)譯功能性蛋白，在目的基因與載體重組連接時， 目的基因編碼的方向必須與載體 DNA啟動子方向相同 ，并要保持目的基因轉(zhuǎn)譯的相位不產(chǎn)生錯誤，保持原有的 閱讀框架 ，才能正確轉(zhuǎn)譯成氨基酸序列正確的功能蛋白。 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 67 為確保原核細(xì)胞可識別被克隆的真核基因，應(yīng)采用 原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動子和核糖體結(jié)合位點 ，且必須置于該基因的上游鄰近處，于該基因的下游還應(yīng)設(shè)置強(qiáng)終止子，基因的兩側(cè)應(yīng)有不同的 限制性酶切位點 ，以便定向插入，同時還應(yīng)具有 標(biāo)記基因 以便克隆選擇 。 表達(dá)載體在 P 起動子 R 核糖體結(jié)合位點 T 終止子 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 68 原核細(xì)胞表達(dá)載體的類型 非融合型 pKK2233結(jié)構(gòu) 分泌型 PINⅢ ompA1結(jié)構(gòu) 融合蛋白表達(dá)載體 pGEX結(jié)構(gòu) 包涵體型 pBV220結(jié)構(gòu) ? 融合蛋白表達(dá)載體 ? 非融合型表達(dá)載體 ? 分泌型表達(dá)載體 ? 包涵體型表達(dá)載體 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 69 真核細(xì)胞表達(dá)載體的種類 載體的類型 ? 質(zhì)粒型載體 ? 病毒載體 ? 整合型表達(dá)載體 ? 游離型表達(dá)載體 ? 瞬時表達(dá)載體 ? 穩(wěn)定性表達(dá) ? 非復(fù)制型表達(dá)載體 ? 細(xì)胞裂解型表達(dá)載體 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 70 幾種常用的真核表達(dá)載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒 （ retrovirus， RV） 載體是目前唯一的 RNA病毒載體，在鳥類和哺乳動物中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多逆轉(zhuǎn)錄病毒，如鳥類的脾壞死病毒 (SNV)、勞氏肉瘤病毒 (RSV)、鼠類的乳腺瘤病毒 (MMTV)等。 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 71 痘類病毒載體 痘苗病毒可不依賴宿主細(xì)胞，獨立于細(xì)胞質(zhì)中（而不在核中）進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，無致癌性。 第三節(jié) 分子克隆常用的載體 72 HSVI單純瘡疹病毒載體 是一類雙鏈 DNA病毒，有 80個以上基因，其中以 HSVI型備受關(guān)注。 HSVI基因組較大，可達(dá) 150kb，許多基因均可缺失，但病毒仍有復(fù)制能力，因此為 大片段外源基因 的插入提供了條件，且插入容量大，至少可插入 30kb的外源基因。 第三節(jié)