生命科學(xué)進(jìn)展ppt課件(編輯修改稿)
2025-06-08 12:34 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 析。 噬菌體表面展示應(yīng)用范圍 ? 應(yīng)用范圍非常廣； ? 可用于高通量篩選； ? 可研究含量很低的與配體特異作用的蛋白質(zhì)； ? 可直接得到相互作用蛋白的編碼序列。 噬菌體表面展示優(yōu)點(diǎn) ? 需要標(biāo)記的抗體或配體來檢測結(jié)合情況； ? 外源蛋白大小受到限制，不能研究大分子量蛋白質(zhì)的相互作用； ? 原核表達(dá)體系中外源蛋白質(zhì)無法正確折疊或修飾； ? 融合蛋白可能會影響到蛋白質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)或生物活性。 噬菌體表面展示缺點(diǎn) 1. 谷胱苷肽 S轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗(yàn) (GSTpull down) 三、基于親和層析的蛋白質(zhì)相互作用研究平臺 2. 免疫共沉淀 (Coimmunoprecipitation) 3. Ligand blot 基本原理是將一種蛋白質(zhì)或抗體固定于某種基質(zhì)上（如 Sepharose，NC膜或 PVDF膜等），當(dāng)細(xì)胞抽提液經(jīng)過改基質(zhì)時(shí)，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有吸附的非目標(biāo)蛋白則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過改變洗脫液或者洗脫條件而回收下來，然后對其進(jìn)行分析鑒定。 1. 谷胱苷肽 S轉(zhuǎn)移酶沉淀試驗(yàn) (GSTpull down) 1988年 smith等利用谷胱甘肽 S轉(zhuǎn)移酶融合標(biāo)簽從細(xì)菌中一步純化出 GST融合蛋白，從此 GST融合蛋白在蛋白質(zhì)相互作用研究領(lǐng)域里得到了極大的推廣。 GSTpull down方法是將誘餌蛋白質(zhì)和 GST標(biāo)簽融合表達(dá)。一步純化后與含有目的蛋白質(zhì)的溶液培育，之后利用谷胱甘肽 瓊脂糖 球 珠將融合蛋白 :目的蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳或質(zhì)譜鑒定與誘餌蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)。 GST X 谷胱甘肽 瓊脂糖球珠 細(xì)胞裂解物 4℃ 下孵育 2h GST融合蛋白 GST X GST X GST X Y GSTpull down篩選未知的結(jié)合蛋白 設(shè)置 GST對照，排除 GST的影響 Y Y Y Bind Wash to remove unbound protein Elute Analyze Bind GSTpull down驗(yàn)證兩個(gè)已知蛋白的相互作用 GST X 谷胱甘肽 瓊脂糖球珠 純化的 Y蛋白 4℃ 下孵育 2h GST融合蛋白 GST X GST X GST + + GST 純化的 Y蛋白 GST Y Y Y Bind Wash to remove unbound protein Detect Bind Bind 1. 不需要制備抗體來檢測結(jié)合情況； 2. 不需要對誘餌蛋白進(jìn)行標(biāo)記，避免了使用同位素等危險(xiǎn)物質(zhì)； GSTpull down的優(yōu)點(diǎn) GSTpull down的缺點(diǎn) 2. 假陽性。蛋白質(zhì)所帶電荷引起的，并不是生理性的相互作用； 有時(shí)會檢測到兩種在細(xì)胞中不可能相遇卻有極強(qiáng)親和力的蛋白。 1. 該方法只適用于確定體外的相互作用； 3. 融合蛋白可能會影響蛋白的真實(shí)結(jié)構(gòu)和功能。 ? 原理： 當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)
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