體上課用ppt課件(編輯修改稿)
2025-06-08 05:51 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 注入 復(fù)制 包裝 裂解 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA l 噬菌體生物學(xué)特性： 溶原狀態(tài) l噬菌體感染大腸桿菌后 ， 除能裂解細(xì)胞外 ， 也可能將其DNA直接整合到宿主細(xì)胞的染色體 DNA上 ， 并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒 ， 這種情況為 溶原狀態(tài) 。 人們可以根據(jù)需要改變 lDNA或宿主細(xì)胞的性質(zhì) ， 使噬菌體處于 溶菌狀態(tài) 。 DNA重組技術(shù)一般需要 l噬菌體進(jìn)入溶菌狀態(tài) 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 縮短長度 野生型 lDNA包裝的上限為 51kb， 本身長度為 ， 只有當(dāng)插入的外源 DNA片段不大于 ， 才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒 。 因此縮短野生型 lDNA的長度 ， 可以提高裝載量 。 其實野生型 lDNA上約有 4050%的片段是復(fù)制和裂解所非必需的 。 根據(jù)切除的多少 ， 可將 lDNA分成兩大類載體： 插入型載體 取代型載體 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 刪除重復(fù)的酶切位點(diǎn) 野生型的 lDNA鏈上有 5個 EcoRI位點(diǎn)和 7個 HindIII位點(diǎn)，不 利于重組操作，必須刪除至 1 2個 同時，為了便于各種來源的 DNA片段的克隆，還需要增加一 些單一的酶切位點(diǎn) 除了簡單的切割外，還需要采用定點(diǎn)突變技術(shù)去除或增添酶 位點(diǎn) 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 加裝選擇標(biāo)記 與質(zhì)粒不同，野生型 lDNA上缺少合適的選擇標(biāo)記，因此 加裝 選擇標(biāo)記是 lDNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容 lDNA克隆載體上的選擇標(biāo)記主要有下列兩類： 免疫功能類標(biāo)記 顏色反應(yīng)類標(biāo)記 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 加裝選擇標(biāo)記 imm434 imm434基因編碼一種阻止 l噬菌體 進(jìn)入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標(biāo)記 基因的 l載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，建立溶 原狀態(tài)，細(xì)菌生長緩慢，形成渾濁斑； 當(dāng)外源 DNA插入到標(biāo)記基因中，基因滅 活， l重組分子便進(jìn)入溶菌循環(huán)，形成 透明斑 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 加裝選擇標(biāo)記 lacZ lacZ基因編碼 b半乳糖苷酶，能催化 無色的 Xgal生成藍(lán)色化合物。當(dāng)外源基 因插入到 lacZ基因中，基因滅活，不能 合成藍(lán)色化合物；而空載體 lDNA則產(chǎn) 生藍(lán)色透明斑 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA載體的構(gòu)建： 構(gòu)建琥珀密碼子的突變體（無義突變） 琥珀型突變 （ sup)是指由 CAG（ Gln） 向 UAG（ stop） 的突變 。將野生型 lDNA上 D和 E兩個頭部包裝蛋白的基因中的 CAG密碼子突變成 UAG。 當(dāng)這種 lDNA進(jìn)入 一般的 大腸桿菌菌株后 ， 不能合成有活性的頭部蛋白 ， 也就不能被包裝和裂解細(xì)菌 ， 這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴(kuò)散 。 噬菌體或病毒 DNA 大腸桿菌的 l 噬菌體 DNA lDNA重組分子的體外包裝： lDNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒 ， 方可高效導(dǎo)入受體細(xì)胞 用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了 l噬菌體的大腸桿菌中提取 ， 現(xiàn)已商品化 。 這些包裝蛋白通常分為相互互補(bǔ)的兩部分：一部分缺少 E組份 ， 另一部分則缺少 D組份 。 包裝時 ， 當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組 lDNA分子混合后 ， 包裝才能
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