【文章內(nèi)容簡介】 1天 ， 經(jīng)過卵 、 幼蟲 、 蛹和成蟲 4個階段 。 果蠅卵呈長橢圓形 ， 精子通過卵殼前部的卵孔入卵 .其 胚胎發(fā)育很快 ， 受精卵在 24h內(nèi)就可以孵化為幼蟲 . 卵裂為 表面卵裂 。 在早期階段 ， 合子核進行一系列快速分裂 ， 而胞質(zhì)不分裂 ， 形成 合胞體 (syncytium).核第 8次分裂 后 ,在胚胎最后部的核最先被細胞膜分隔形成 極細胞 ， 將形成生殖細胞 。 核第 9次分裂 后 ， 大部分核開始遷移到卵的邊緣 ， 稱為 合胞體胚盤 (syncytial blastoderm). 受精約 3個小時后 ， 卵周邊的核被新形成的胞膜包圍 ， 形成 細胞化胚盤 (celluar blastoderm). 原腸作用過程 (圖緒 .8)中 ， 先是 胚胎腹側(cè)的預(yù)定中胚層細胞沿腹中線內(nèi)陷 ， 形成 腹溝 (ventral furrow)。 隨后這部分細胞與表層組織分離 ， 形成 中胚層管 。 這些細胞將遷移至外胚層下 ， 發(fā)育成為肌肉和其他結(jié)締組織 。 隨著中胚層組織的內(nèi)陷 ， 原來位于胚胎背側(cè)的細胞也逐漸向腹側(cè)遷移集中 。 仍停留在背側(cè)的少量細胞不再繼續(xù)分裂 ， 也不參與胚胎本身的構(gòu)成 ， 而是形成胚外組織 ，稱為 羊漿膜 (amnioserosa) 。 而 集中于胚胎腹側(cè)的細胞帶 稱為 胚帶(germ band)。 胚帶 包含了外胚層和位于其下方的中胚層組織 ， 將來 形成胚胎的主體結(jié)構(gòu) ， 也是將要分節(jié)的部分 。 位于 外胚層最腹側(cè)的 預(yù)定神經(jīng)母細胞逐漸陷入胚胎內(nèi)部 ， 發(fā)育為神經(jīng)組織 。 位于 腹溝前后兩端的內(nèi)胚層細胞也分別內(nèi)陷 ， 分別形成中腸的前部和后部 ，兩者隨后融合形成完整的中腸 。 在中腸細胞內(nèi)陷時 ， 在其前后部 同時帶人一部分外胚層細胞內(nèi)陷 ， 分別形成前腸和后腸 。 隨著原腸作用的進行 ， 胚帶開始延伸 ， 胚帶后端不斷向背側(cè)延伸并折向前方 。 到胚帶延伸完成時 ， 胚帶開始出現(xiàn)分節(jié) 。 胚胎的表皮出現(xiàn)一系列均勻分布的小溝 ， 將胚胎分為 14個區(qū)域 ， 此時出現(xiàn)的分節(jié)是 副體節(jié) 。 副體節(jié)與后來的體節(jié)在位置上并不對應(yīng) ， 每一體節(jié)包含前一副體節(jié)的后 2/3與后一副體節(jié)的前 1/3。 副體節(jié)在胚胎發(fā)育中的出現(xiàn)是短暫的 ， 但它奠定了胚胎軀體結(jié)構(gòu)劃分的基礎(chǔ) ， 也是許多分節(jié)基因表達區(qū)域的基本單位 。 大約在 h胚帶開始回縮 ， 在這一過程中胚胎開始出現(xiàn)明確的 體節(jié) ， 包括 3個頭部體節(jié) ， 3個胸部體節(jié) ， 8個腹部體節(jié)和 1個尾節(jié) . 果蠅胚胎大約在受精后 24 h孵出成為幼蟲 。 幼蟲要經(jīng)過兩次蛻皮 ， 因此分為 3齡幼蟲 。 幼蟲表皮具有規(guī)則分布的 齒狀突起帶 (denticle belt)， 這些突起帶的形狀和大小具有體節(jié)特異性 ， 這些是研究果蠅胚胎前一后軸和背 腹軸發(fā)育的重要表型依據(jù) 。 果蠅的 3 齡幼蟲化成蛹 ， 在激素刺激下發(fā)生變態(tài) ， 由幼蟲變?yōu)槌上x 。 在變態(tài)過程中大部分幼蟲組織被吸收而被成體結(jié)構(gòu)所代替 。 果蠅成體的許多結(jié)構(gòu)都是由 成蟲盤 (imaginal disc)發(fā)育而來的 ， 包括 腿 、 翅膀 、 眼睛 、 觸角及生殖腺 等 。 成蟲盤是在胚胎發(fā)育階段由特定區(qū)域的表皮細胞群內(nèi)陷形成的囊狀結(jié)構(gòu) 。 2. 線蟲：秀麗隱桿線蟲 (Caenorhabditis elegans) 英國科學家 Sydney Brenner在 20世紀 60年代開始選擇線蟲作為發(fā)育生物學模式動物 ， 他 與其合作者 H Robert Horvitz和 John E Sulston獲得了 2022 年的諾貝爾生理學或醫(yī)學獎 。 線蟲成蟲僅 約 1mm長 ， 構(gòu)造簡單 ， 全身透明 ， 細胞數(shù)目少 ， 發(fā)育中的 細胞譜系 (cell lineage)幾乎固定 ， 易于追蹤 。 線蟲 生命周期短 ， 培養(yǎng)簡單 ， 便于遺傳突變篩選 ， 并可用液氮長期保存 。 線蟲的基因組測序已在 1998年完成 (共含 19 099個基因 ) ， 是第一個完成全基因組測序的多細胞動物 . 線蟲 分雌雄同體 和 雄性 兩性別 ， 雌雄同體為主要形式 .雌雄同體個體的性染色體為 xx型 ， 而雄性個體為 xo型 ， 只一條性染色體 .雄體是減數(shù)分裂過程中由于染色體丟失造成的 。 雌雄同體個體可通過自體受精產(chǎn)生后代 ， 也可與雄性個體交配異體受精 。 成熟的雌雄同體個體具有 959個體細胞 ， 約 2 000個生殖細胞 。 雄蟲則有 1 031個體細胞 和約 1 000個生殖細胞 . 線蟲大致 呈圓柱形 ， 外表覆有角質(zhì)化層 ， 下方為下皮層(hypodermis)， 然后是肌肉 。 消化系統(tǒng)包括咽和腸道 。 其體腔為假體腔 ， 體腔周圍沒有中胚層細胞包被 。 雌雄同體 性腺為雙臂狀 ， 開口至腹側(cè)中部的陰門 。 在性腺中 ，距陰門最近的細胞分化為精子貯存于體內(nèi) 。 卵子細胞核產(chǎn)生于性腺遠端 ， 通過減數(shù)分裂形成 ， 它們 最初以合胞體狀態(tài)存在 ， 直到受精前才形成完整的細胞膜 。 卵子在產(chǎn)出的過程中受精 ， 在排出母體時通常處于卵裂階段 (約 40個細胞 )。 雄體性腺為 單臂狀 ， 只能產(chǎn)生精子 。 在 250C條件下 ， 線蟲 完成一個生命周期約需 (圖緒 .9)。 胚胎的前后軸是由精子人卵處決定的 ， 精子入卵的部分成為胚胎的后端 。 精子入卵引起卵質(zhì)的重組 ， 受精卵中間部分出現(xiàn)一個 “ 分裂溝 ” ， 但此時并不真正分裂 ， 稱為 “ 假卵裂 ” ( pseudocleavage) .合子卵裂為 不對稱卵裂 (圖緒 .10) 第一次卵裂后前部的細胞為 AB細胞 ， 而后段的細胞稱為 P細胞 。AB細胞繼續(xù)分裂為 ABa和 ABp細胞 。 而 P細胞后幾次的分裂方式則類似干細胞 ， 即每次分裂后都保持其中一個細胞為 P細胞 ,另外一個細胞分別為 EMS, C和 D細胞 (圖緒 .10)。 P4 細胞是生殖細胞前體 。 EMS細胞繼續(xù)分裂為一個 E細胞和一個 MS細胞 .E細胞將發(fā)育為內(nèi)胚層細胞 。 線蟲胚胎的 “ 原腸作用 ” 持續(xù)時間較長 。 在 28細胞時期 ， 兩個 E細胞開始向內(nèi)部遷移 ， 此時可以算作是原腸作用的開始 。 隨后由 C和 D細胞產(chǎn)生的肌細胞 和由 ABa細胞產(chǎn)生的咽 細胞也依次由腹裂 (ventral cleft)卷入胚胎內(nèi)部 。 胚胎的腹裂相當于胚孔 。 腹裂在 290細胞時期合 。 胚胎在 受精后約 14 h孵化成為幼蟲 。 線蟲 胚胎發(fā)育過程中的細胞分裂方式一成不變 ， 其細胞譜系已被完全確定 (圖緒 .11).幼蟲經(jīng) 4次蛻皮成為成體 ， 然后在 3天內(nèi)產(chǎn)下300多個卵 ， 并在 2周后死亡 . 五、發(fā)育生物學研究技術(shù) (一 )常用發(fā)育生物學研究技術(shù) 由于胚胎個體通常很小，顯微鏡和解剖鏡仍是發(fā)育生物學研究的必備工具。除了常規(guī)的光學顯微鏡外，一些特殊的顯微鏡也廣泛用于發(fā)育生物學研究。例如， 相差顯微鏡 (phase contrast microscope)和微分干涉差顯微鏡 (differential interference. contrast microscope)適用于觀察活的或未染色的樣品的精細結(jié)構(gòu) . ? 取材、固定、 脫水、 包埋、制片、染色、觀察 透射電鏡術(shù) :取材 、 固定 、 脫水、 包埋 、 制片 、 染色 、觀察 ? 組織塊 (lmm3)用 戊二醛與餓酸兩次固定 ， 脫水后樹脂包埋 ， 用超薄切片機切片 ， 再經(jīng)醋酸鈾和擰橡酸鉛染色 。 ? 電子束射落到切片時 ， 隨細胞構(gòu)成成分的密度以及吸附重金屬鈾 、 鉛 、 餓的程度不同 ,而發(fā)生相應(yīng)的電子散射 。 當電子束技射到密度大 、 吸附重金屬多的結(jié)構(gòu) (如溶酶體 )時 ， 電子被散射得多 ， 因此 ， 射落到熒光屏上的電子少而呈暗像 ， 電鏡照片上呈黑或深灰色 ， 習慣稱該結(jié)構(gòu)為 高電子密度 ；反之呈淺灰色 ， 稱低電子密度 。 掃描電鏡術(shù) ： 不需要制備切片，組織塊 (約 )用戊二醛 和餓酸 固定，經(jīng)脫水干燥，表面噴鍍薄層碳與金屬膜，觀察 . 激光掃描共聚焦顯微鏡 (laser scanning confocal microscope)是 20世紀 80年代初研制成功的一種高光敏度 、 高分辨率的新型儀器 ，近年來在發(fā)育生物學領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用 . 共聚焦顯微鏡 是在熒光顯微鏡基礎(chǔ)上發(fā)展起來的 。 某些熒光物質(zhì)(如熒光標記染料或熒光蛋白 )在一定波長的激發(fā)光照射下會發(fā)出熒光 。 利用熒光染料標記的特異性抗體或探針 ， 可對胚胎或細胞中的特定蛋白或 mRNA的分布進行定性和定量研究 。 傳統(tǒng)的熒光顯微鏡的最大缺點是成像質(zhì)量差 。 共聚焦顯微鏡技術(shù)很好地解決了這一問題 。 ? 要觀察到胚胎的內(nèi)部結(jié)構(gòu) ， 通常要進行組織切片 。 ? 最常用的技術(shù)是石蠟切片技術(shù) 。 石蠟切片術(shù) (paraffin sectioning)： 取材 、 固定 、 脫水 、 包埋 、 切片 (5～ 10181。m 厚 )(連續(xù)切片 ） 、 貼片 、 脫蠟 、 染色 、 觀察 蘇木精 伊紅染色法 (hematoxylineosin staining， HE染色法 )： 蘇木精為堿性染料 ， 使染色質(zhì)和核糖體著紫藍色；伊紅為酸性染料使胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)著紅色 冷凍切片 是利用特殊的低溫包埋劑對樣品進行包埋 ， 在低溫條件下進行切片的技術(shù) 。 通常冷凍切片的質(zhì)量比石蠟切片要差 ，也很難進行連續(xù)切片 ， 但 方便快捷 ,對樣品中蛋白質(zhì)和核酸的保存也較好 。 特殊染色 ? 用 硝酸銀將神經(jīng)細胞染為黑色 (鍍銀染色法 ) ? 用 醛復(fù)紅將彈性纖維和肥大細胞的分泌顆粒染為紫色 . 活體染色 ? 將無毒或毒性小的染料經(jīng)靜脈注入后 ， 再取材制成切片觀察 .如注入的 臺盼藍 (trypan blue)可被肝 、 脾器官內(nèi)的巨噬細胞吞噬 . ? 在組織化學術(shù) ,常使用 熒光染料染色 或作為標記物 ,用熒光顯微鏡觀察 （ immunohistochemistry） 根據(jù)抗原 、 抗體特異性結(jié)合原理 ， 檢測組織切片中的肽和蛋白質(zhì) 用標記的抗體與組織中的抗原結(jié)合 ， 標記物可于顯微鏡下觀察 。 肽和蛋白質(zhì)均具有抗原性 。 當把人或動物的某種肽或蛋白質(zhì)作為抗原注入另一種動物 ， 其體內(nèi)會產(chǎn)生針對該抗原的特異性抗體 (免疫球蛋白 )。 將抗體從動物血清中提出后 ， 與標記物相結(jié)合 ， 即成