j克隆dna的分析與應(yīng)用(編輯修改稿)
2025-06-03 18:09 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 T)+4(G+C)。 ? 如果 PCR產(chǎn)物要用于克隆，最好在引物 5’ 端加上單一的限制酶切位點(diǎn)。 ? 如果目的 DNA序列是未知的，例如克隆一個(gè)只知道部分氨基酸序列的蛋白的 cDNA， 設(shè)計(jì)引物就會比較困難。因此可通過遺傳密碼解出編碼已知氨基酸序列的 DNA序列，再設(shè)計(jì)出 簡并引物 。 酶 ? 其中最常用的 Taq聚合酶是從 Thermus aquaticus菌中制備的。 ? 該酶能經(jīng)受 l－ 2min 95℃ 變性步驟，在該溫度下的半衰期大于2h。 由于不具備 3’ － 5’ 的校正外切酶活性， 已知 Taq酶在復(fù)制 DNA時(shí)會引入錯(cuò)誤，大約每聚合 250nt發(fā)生一次錯(cuò)誤。 ? 由于這一原因，常選用其他精度更高的熱穩(wěn)定 DNA聚合酶用于某些特定的實(shí)驗(yàn)。 如： Ex – Taq酶 (TaKaRa) 或 pfu 酶 PCR循環(huán)：變性 (94℃ )、 退火（ 50－ 60℃ ）、延伸（ 72℃ ） PCR的條件優(yōu)化 ? 即使使用已克隆的 DNA和己知序列的引物，一般 PCR效率也不會達(dá)到 100％，通常都要優(yōu)化反應(yīng)條件以期提高效率。 ? 當(dāng)試圖從眾多序列中擴(kuò)增出一特定目標(biāo)序列，如從基因組 DNA中擴(kuò)增一個(gè)基因、或從 cDNA文庫或第一鏈 cDNA合成的產(chǎn)物中擴(kuò)增一個(gè) cDNA時(shí)，條件優(yōu)化尤為重要。 ? 常改變的參數(shù)是 退火溫度 和 Mg2＋ 濃度 。 PCR optimization 變性溫度和時(shí)間 9295℃ ，富含 G和 C的序列，可適當(dāng)提高，但過高或時(shí)間過長都會導(dǎo)致酶活性損失。 退火溫度與時(shí)間 引物中 G、 C含量高、 長度長并與模板完全配對時(shí)，應(yīng)提高溫度。溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。通常 3755℃ 、 12分鐘。 延伸溫度和時(shí)間 溫度： 72℃ ，接近 Taq酶的最適 75℃ 時(shí)間：過長會導(dǎo)致產(chǎn)物非特異性增加。但對低濃度的目的序列，則可適當(dāng)增加時(shí)間。 循環(huán)次數(shù) 循環(huán)過多，非特異性產(chǎn)物大量增加 PCR污染及其對策 強(qiáng)大擴(kuò)增能力 +檢測的敏感性 極微量的污染便可導(dǎo)致假陽性 污染源的追蹤 ①點(diǎn)樣器和加樣器 。② 離心機(jī) 。③ 微解剖刀 。④ 濃縮用具、真空瓶 。⑤ 電泳裝置 。⑥ 紫外燈箱 。⑦ 乙醇或水浴鍋 。⑧ 冰箱門把手、實(shí)驗(yàn)臺面等 污染的預(yù)防 (1)隔離不同操作區(qū) (2)分裝試劑 (3)改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作 (4)專用加樣器 (5)結(jié)果的重演 J3 克隆基因的組構(gòu) (不要求 ) ? 以寡脫氧胸腺苷酸引
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