hbvcccdna及其意義(編輯修改稿)
2025-06-03 18:08 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 將rcDNA降解成單鏈，然后再用綠豆核酸酶酶切。 感染科 20220815 23 ? 該方法也有其缺點(diǎn)：如抽提產(chǎn)物被稀釋，降低了檢測敏感度；綠豆核酸酶的反應(yīng)緩沖液對 PCR反應(yīng)有抑制作用等。 ? 繆曉輝等 嘗試用小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提去抽提 cccDNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)得率比上述所用方法均要高，操作也簡便，所有操作在30分鐘內(nèi)就可完成。 感染科 20220815 24 ?2 .cccDNA的定性檢測 ? 既往絕大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的是用Southern blot對 cccDNA進(jìn)行定性檢測，該方法是分子生物學(xué)的經(jīng)典方法，但技術(shù)要求較高，敏感度低。 感染科 20220815 25 ? 近年來，也有較多文獻(xiàn)報(bào)道用 PCR技術(shù)對 cccDNA進(jìn)行檢測。但是，由于 PCR技術(shù)靈敏度極高，rcDNA和 cccDNA的序列又具有高度的同源性，因此在用 PCR技術(shù)檢測 cccDNA時(shí)，必須確保只能擴(kuò)增 cccDNA而 rcDNA不被擴(kuò)增。目前利用 rcDNA和cccDNA結(jié)構(gòu)上的差異可以解決這一問題。由于rcDNA的正鏈和負(fù)鏈上均存在缺口，故可以設(shè)計(jì)跨越兩個(gè)缺口的引物，使 rcDNA不會被擴(kuò)增，而cccDNA由于是完整的雙鏈結(jié)構(gòu)則可以被選擇性擴(kuò)增。同時(shí)可設(shè)計(jì)另一對不跨越缺口的引物或只跨越一條鏈的缺口的引物同時(shí)檢測 cccDNA和rcDNA[圖 1]。 Kock等成功地用這種選擇性 PCR的方法在檢測感染細(xì)胞內(nèi)的 cccDNA和 rcDNA。 感染科 20220815 26 ? 此外，為進(jìn)一步提高檢測的靈敏度，可用套式 PCR(nested PCR)的方法。 感染科 20220815 27 感染科 20220815 28 ? 但是有報(bào)道認(rèn)為跨缺口引物對兩種DNA的選擇性不是絕對的，在 PCR檢測cccDNA時(shí)，起始模板量不能過高，否則 rcDNA也有可能被擴(kuò)增， Kock等發(fā)現(xiàn)每個(gè) PCR反應(yīng)管中 HBV DNA的量在 1 pg（約 6 105拷貝）時(shí)能達(dá)到最佳的靈敏度與選擇性，因此在分析前應(yīng)估計(jì)標(biāo)本中 HBV DNA的量。雖然套式 PCR更為靈敏，但由于需取 PCR產(chǎn)物進(jìn)行再次擴(kuò)增，因此在操作中要注意防止PCR產(chǎn)物污染，避免假陽性。 感染科 20220815 29 ? 3 .cccDNA的定量檢測 ? 在定性檢測的基礎(chǔ)上，可以進(jìn)一步對cccDNA進(jìn)行定量檢測。仍以 PCR定量分析技術(shù)中，尤其是競爭 PCR技術(shù)的敏感性和精確度高。方法是在 PCR反應(yīng)管中加入一種已知量的、能與野生模板等效擴(kuò)增的內(nèi)參照，內(nèi)參照是經(jīng)過突變處理的，其兩端尤其是引物退火區(qū)的序列與野生模板相同。 PCR擴(kuò)增后通過一定的方法將野生片段與突變片段區(qū)分開，分別計(jì)算其絕對量，或求出其相對比值，就可以推算 PCR擴(kuò)增以前野生模板的量。 感染科 20220815 30 ? He等建立了實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測 cccDNA的方法。他們將 Taqman MGB探針設(shè)計(jì)在負(fù)鏈缺刻的下游，與負(fù)鏈互補(bǔ)結(jié)合。對 cccDNA，在上游引物的引導(dǎo)下， Taq酶到達(dá) Taqman MGB探針?biāo)Y(jié)合的位點(diǎn)，利用其 5’→3 ’外切活性將探針切斷， 3’端的淬滅基團(tuán)失去對 5’端的發(fā)光基團(tuán)的抑制作用，從而產(chǎn)生熒光信號。每擴(kuò)增一個(gè) cccDNA分子，就會產(chǎn)生一個(gè)熒光信號， PCR儀可對產(chǎn)生的信號進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，根據(jù)熒光信號的強(qiáng)弱對 cccDNA進(jìn)行定量。對 rcDNA，由于上游引物引發(fā)的鏈延伸不能通過負(fù)鏈缺刻，故不能使 Taqman MGB探針被 Taq酶切斷產(chǎn)生熒光信號。該方法的特異性比選擇性 PCR進(jìn)一步提高，可以消除高 rcDNA背景可能產(chǎn)生的非特異性擴(kuò)增。該方法的檢測低限可達(dá) 100個(gè)拷貝，靈敏度比目前應(yīng)用的任何一種其它方法都高。所有檢測在 2小時(shí)內(nèi)可完成。 感染科 20220815 31 ? 還有其他一些更為敏感的檢測方法，如 Shao等報(bào)告的兩步法對 cccDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。其設(shè)計(jì)與 He等的方法有異曲同工之處，即都是利用 rcDNA與 cccDNA分
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