hbvcccdna及其意義(編輯修改稿)
2025-06-03 18:08 本頁面
【文章內容簡介】 將rcDNA降解成單鏈，然后再用綠豆核酸酶酶切。 感染科 20220815 23 ? 該方法也有其缺點：如抽提產物被稀釋，降低了檢測敏感度；綠豆核酸酶的反應緩沖液對 PCR反應有抑制作用等。 ? 繆曉輝等 嘗試用小量質粒抽提試劑盒抽提去抽提 cccDNA，結果發(fā)現(xiàn)得率比上述所用方法均要高，操作也簡便，所有操作在30分鐘內就可完成。 感染科 20220815 24 ?2 .cccDNA的定性檢測 ? 既往絕大多數(shù)文獻報道的是用Southern blot對 cccDNA進行定性檢測，該方法是分子生物學的經(jīng)典方法，但技術要求較高，敏感度低。 感染科 20220815 25 ? 近年來，也有較多文獻報道用 PCR技術對 cccDNA進行檢測。但是，由于 PCR技術靈敏度極高，rcDNA和 cccDNA的序列又具有高度的同源性，因此在用 PCR技術檢測 cccDNA時，必須確保只能擴增 cccDNA而 rcDNA不被擴增。目前利用 rcDNA和cccDNA結構上的差異可以解決這一問題。由于rcDNA的正鏈和負鏈上均存在缺口，故可以設計跨越兩個缺口的引物，使 rcDNA不會被擴增，而cccDNA由于是完整的雙鏈結構則可以被選擇性擴增。同時可設計另一對不跨越缺口的引物或只跨越一條鏈的缺口的引物同時檢測 cccDNA和rcDNA[圖 1]。 Kock等成功地用這種選擇性 PCR的方法在檢測感染細胞內的 cccDNA和 rcDNA。 感染科 20220815 26 ? 此外，為進一步提高檢測的靈敏度，可用套式 PCR(nested PCR)的方法。 感染科 20220815 27 感染科 20220815 28 ? 但是有報道認為跨缺口引物對兩種DNA的選擇性不是絕對的，在 PCR檢測cccDNA時，起始模板量不能過高，否則 rcDNA也有可能被擴增， Kock等發(fā)現(xiàn)每個 PCR反應管中 HBV DNA的量在 1 pg（約 6 105拷貝）時能達到最佳的靈敏度與選擇性，因此在分析前應估計標本中 HBV DNA的量。雖然套式 PCR更為靈敏，但由于需取 PCR產物進行再次擴增，因此在操作中要注意防止PCR產物污染，避免假陽性。 感染科 20220815 29 ? 3 .cccDNA的定量檢測 ? 在定性檢測的基礎上，可以進一步對cccDNA進行定量檢測。仍以 PCR定量分析技術中，尤其是競爭 PCR技術的敏感性和精確度高。方法是在 PCR反應管中加入一種已知量的、能與野生模板等效擴增的內參照，內參照是經(jīng)過突變處理的，其兩端尤其是引物退火區(qū)的序列與野生模板相同。 PCR擴增后通過一定的方法將野生片段與突變片段區(qū)分開，分別計算其絕對量，或求出其相對比值，就可以推算 PCR擴增以前野生模板的量。 感染科 20220815 30 ? He等建立了實時熒光定量 PCR檢測 cccDNA的方法。他們將 Taqman MGB探針設計在負鏈缺刻的下游，與負鏈互補結合。對 cccDNA，在上游引物的引導下， Taq酶到達 Taqman MGB探針所結合的位點，利用其 5’→3 ’外切活性將探針切斷， 3’端的淬滅基團失去對 5’端的發(fā)光基團的抑制作用，從而產生熒光信號。每擴增一個 cccDNA分子，就會產生一個熒光信號， PCR儀可對產生的信號進行實時監(jiān)測，根據(jù)熒光信號的強弱對 cccDNA進行定量。對 rcDNA，由于上游引物引發(fā)的鏈延伸不能通過負鏈缺刻，故不能使 Taqman MGB探針被 Taq酶切斷產生熒光信號。該方法的特異性比選擇性 PCR進一步提高，可以消除高 rcDNA背景可能產生的非特異性擴增。該方法的檢測低限可達 100個拷貝，靈敏度比目前應用的任何一種其它方法都高。所有檢測在 2小時內可完成。 感染科 20220815 31 ? 還有其他一些更為敏感的檢測方法，如 Shao等報告的兩步法對 cccDNA進行實時熒光定量。其設計與 He等的方法有異曲同工之處，即都是利用 rcDNA與 cccDNA分
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