sdspage原理ppt課件(2)(編輯修改稿)
2025-06-01 18:23 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 90分鐘才能完成。溫度與聚合的快慢成正比。通常在室溫下就很快聚合，溫度升高聚合更快。如將混合后的凝膠溶液放在近 0℃ 的地方，就能延緩聚合。一般來講，溫度過低，有氧分子或不純物質(zhì)存在時都能延緩凝膠的聚合。為了防止溶液中氣泡含有氧分子而妨礙聚合，在聚合前須將溶液分別抽氣，然后再混合。 不連續(xù)系統(tǒng)由上層濃縮膠和下層的分離膠組成。濃縮膠（ ，孔徑大）主要作用是使樣品濃縮，使樣品在未進(jìn)入分離膠前，被濃縮成很窄的條帶，從而提高分離效果。分離膠（ ，孔徑?。┩ㄟ^分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，把樣品中的各組分按分子量和電荷的大小而分開。 如果要利用凝膠電泳測定某一蛋白質(zhì)的分子量就必須將電荷效應(yīng)去掉或減少到可以忽略不計的程度，使蛋白質(zhì)泳動率的大小完全取決于分子量。如何去除電荷效應(yīng)呢？現(xiàn)常用的是十二烷基硫酸鈉（ SDS）。 SDS是一種陰離子去污劑。在電泳體系中加入一定濃度的 SDS， SDS以一定的比例和蛋白質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷，這種負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷，從而減低或消除了各種蛋白質(zhì)分子天然電荷的差異。 十二烷基硫酸鈉 SDS 是陰離子型表面活性劑，它能按一定比例與蛋白質(zhì)分子結(jié)合成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，再與 PAGE技術(shù)結(jié)合，則譜帶差異更加明顯、清晰，并可測定蛋白質(zhì)分子量。 在有去污劑十二烷基硫酸鈉存在下的聚丙烯酰胺凝膠電泳。 SDSPAGE只是按照分子大小分離的，而不是根據(jù)分子所帶的電荷和大小分離的。 SDS帶有大量負(fù)電荷，當(dāng)其與蛋白質(zhì)結(jié)合時，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)原有的負(fù)電荷，因而消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異，使蛋白質(zhì)均帶有相同密度的負(fù)電荷，因而可利用 Mr差異將各種蛋白質(zhì)分開。 最廣泛使用的不連續(xù)緩沖系統(tǒng)最早是由 Ornstein(1964) 和Davis(1964) 設(shè)計的 , 樣品和濃縮膠中含 TrisHCl(pH ), 上下槽緩沖液含 Tris甘氨酸 (pH ), 分離膠中含 TrisHCl(pH )。系統(tǒng)中所有組分都含有 % 的 SDS(Laemmli, 1970)。樣品和濃縮膠中的氯離子形成移動界面的先導(dǎo)邊界而甘氨酸分子則組成尾隨邊界，在移動界面的兩邊界之間是一電導(dǎo)較低而電位滴度較陡的區(qū)域 , 它推動樣品中的蛋白質(zhì)前移并在分離膠前沿積聚。此處 pH值較高， 有利于甘氨酸的離子化，所形成的甘氨酸離子穿過堆集的蛋白質(zhì)并緊隨氯離子之后，沿分離膠泳動。從移動界面中解脫后， SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物成一電位和 pH值均勻的區(qū)帶泳動穿過分離膠，并被篩分而依各自的大小得到分離。 甘氨酸 濃縮效應(yīng)： 凝膠由兩種不同的凝膠層組成。上層為濃縮膠，下層為分離膠。濃縮膠為大孔膠，緩沖液 ，分離膠為小孔膠，緩沖液 。在上下電泳槽內(nèi)充以 Tris— 甘氨酸緩沖液 ()，這樣便形成了凝膠孔徑和緩沖液 pH值的不連續(xù)性。在濃縮膠中 HCl幾乎全部解離為 Cl，但只有極少部分甘氨酸解離為 H2NCH2COO。蛋白質(zhì)的等電點一般在 pH5左右，在此條件下其解離度在 HCl和甘氨酸之間。當(dāng)電泳系統(tǒng)通電后，這 3種離子同向陽極移動。其有效泳動率依次為 Cl＞蛋白質(zhì)＞H2NCH2COO，故 C1稱為快離子，而 H2NCH2COO 稱為慢離子。電泳開始后，快離子在前，在它后面形成離子濃度低的區(qū)域即低電導(dǎo)區(qū)。電導(dǎo)與電壓梯度成反比，所以低電導(dǎo)區(qū)有較高的電壓梯度。這種高電壓梯度使蛋白質(zhì)和慢離子在快離子后面加速移動。在快離子和慢離子之間形成 — 個穩(wěn)定而不斷向陽極移動的界面。由于蛋白質(zhì)的有效移動率恰好介于快慢離子之間，因此
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