帶你認識真正的talent技術-斯丹賽talent技術講座(編輯修改稿)
2025-05-30 18:39 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 除的單克隆 續(xù)上 Knockin 載體構建 構建 knockin同源重組載體 WT Donor ?提高同源重組效率 ?同源臂構建簡單， 5001000bp ?利用抗性基因快速進行篩選 打靶示意圖（基因敲入） Dirk Hockemeyer, Haoyi Wang, Samira engineering of human ES and iPS cells using TALE nucleases,Nat Biotechnol. 。 29(8): 731–734. 打靶示意圖（定點突變） Su Mi Choi, Yonghak Kim,efficient drug screening and gene correction for treating liver disease using patientspecific stem cells . HEP,122140. 打靶示意圖（定點缺失） 打靶效率經(jīng)驗參考 建立 knockout細胞系（雙拷貝敲除）： ? 293T， hela細胞：建系 成功率 100%，目前成功建系 19個 ，打靶效率約為 30 % 70%，最短耗時 2個月 ? ES/iPS細胞： 建系成功率 100%，目前成功建系 7個 ，打靶效率約為 20 % 50%，最短耗時 4個月 數(shù)據(jù)統(tǒng)計至 打靶效率經(jīng)驗參考 建立 knockin細胞系（單拷貝敲入） ： ? 293T、 hela細胞等：建系 成功率 100%，目前已成功建系 6個 ，打靶效率約為 20 % 55%，最短耗時 3個月 ? ES/iPS細胞：建系 成功率 100%，目前已成功建系 2個 ，最短耗時 ，打靶效率約為 10 % 28% 數(shù)據(jù)統(tǒng)計至 成功實例 2 動物模型 — 斑馬魚 Zebra fishgene A 580bp ZebrafishgeneA (Kpn I) 580bp 401bp 179bp Genomic PCR Restrictive enzyme digest 斑馬魚內(nèi) XX基因敲除 結(jié)果回饋 我方設計 TALEN識別序列； 提供最終的 TALEN質(zhì)粒 TALEN質(zhì)粒線性化； 體外轉(zhuǎn)錄 顯微注射一細胞期受精卵 48h后收集，抽提胚胎 基因組 DNA PCR擴增，酶切看結(jié)果 打靶效率為80%以上 應用實例 3 動物模型 —— 小鼠 1. 設計構建 TALEN打靶載 2. 細胞水平 TALEN 活性檢測 3. 體外轉(zhuǎn)錄生成 mRNA 4. 往受精卵 注射 mRNA 5. 得到嵌合體小鼠（ F0） 6. 得到 F1 heterozygote 7. 得到 F2 homozygote 1. 設計構建 TALEN及 KI donor載體 2. 細胞水平 TALEN活性檢測 基因 敲除 小鼠 基因 敲入 小鼠 3. 體外轉(zhuǎn)錄生成 mRNA 4. 往受精卵 注射 mRNA/DNA 混合物 3. 建立 ES基因敲入細胞系 4. 將 ES細胞系注射至囊胚 5. 得到 嵌合體小鼠（ F0） 6. 得到 F1 heterozygote 7. 得到 F2 homozygote 應用實例 3 動物模型 —— 小鼠 PNAS. 2022 Mar。 110(10):37827 ? 應用 I: 基因敲除 TALEN 的實際應用 Nat Biotechnol 2022 Jan。 31(1):234 Phenotypic analysis of genespecific knockout mice has transformed our understanding of in vivo gene functions. Generation of knockout mice, however, remains a timeconsuming and expensive process. Transcription activatorlike (TAL) effector nucleases (TALENs) are highly effective in inducing mutations at specific genomic loci, and consequently TALENmediated mutagenesis in zygotesis a potential alternative to conventional gene targeting in mice. ?
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