帶你認識真正的talent技術-斯丹賽talent技術講座-文庫吧
2025-04-18 18:39 本頁面
【正文】 x16 Position 1 Position 2 Position 3 Position 4 Position 5 Position 6 Position 7 Position 8 Position 9 1/2 9 x 12 dimers, 7 x 4 monomers Complete library: 172 CMV, EF1a, Ubi, 35S, T7, SP6 Maximum RVDs: 19 Minimum RVDs: 12 多種 TALEN骨架載體，滿足不同物種需求 第一組載體： 干細胞 專用打靶載體，采用 EF1α啟動子。 第二組載體：構建 動物模型 專用載體，含有原核表達啟動子 sp6或 T7，便于體外轉錄。 第三組載體： 普通細胞 打靶載體，采用 CMV啟動子。 第四組載體： 植物 專用打靶載體，采用 ubiqutin或 35s啟動子。 TALEN質粒構建流程 靶點設計 挑克隆 細菌培養(yǎng) DNA質粒抽提 酶切鑒定 得到測序 正確質粒 TALEN連接 細菌轉化 質粒測序 Day 1 Day 2 Day 3 Day 4 4天 得到構建正確的 TALEN質粒！ 簡單、快速！ 靶點設計 ? Decide TALEN target (left arm/right arm) ? ? DNASTAR ? Target: 1219bp ? Spacer: 1221bp ? 5‘ end ‘0’ position: must be T ? 為了得到高活性質粒，建議設計 2X3組合。 Spacer 1221bp 5’ 5’ 3’ 3’ TALEN連接 ， 選擇模塊 ， 進行連接 45h完成 ? 轉化至感受態(tài)細胞 ? 在 Kana+ LB平板中培養(yǎng) 細菌轉化 挑單克隆， 細菌培養(yǎng) ? 挑 512 個克隆 （連接效率 ≈ 50%） ? Kana+ LB培養(yǎng)液 單克隆菌落 將單菌落接入含5ml Ka+的 LB培養(yǎng)液的試管中 DNA質粒抽提，酶切鑒定 ? DNA質粒小抽提 ? 使用 BamHI+PstI雙酶切，植物載體采用 BamHI+SpeI target: 15 nt target: 18 nt 左臂 右臂 1kb Marker 1 kb Marker Digestion Digestion Asssembly length: 15x102=1530 Asssembly length: 18x102=1836 On backbone: 531 Total length: 1530+531=2061 On backbone: 531 Total length: 1836+531=2367 1個單模塊（由 34個氨基酸 — 102個堿基組成）識別一個堿基 ? 上游引物 : 5’CTCCCCTTCAGCTGGACAC3’ ? 下游引物 : 5’AGCTGGGCCACGATTGAC3’ 質粒測序 測序結果比對 標準序列 測序結果 得到測序正確質粒 TALEN 的實際應用 DNA水平的 基因敲除 DNA水平的 定點插入 DNA水平的 單堿基修飾 （點突變） ?建立基因敲除 /敲入的真核細胞系 ?建立基因敲除 /敲入的真核生物模型 DNA水平的miRNA敲除 應用實例 1 細胞模型 Hela細胞中 XX基因敲除的穩(wěn)轉系建立： 項目執(zhí)行時長 2個月 設計 TALEN識別序列； 構建 TALEN載體； 測序驗證 質粒正確性 實驗流程： 序列 100%正確 脂質體轉染入 Hela細胞中；puromycin藥物篩選 3天 收集篩選后剩余的部分細胞，抽提基因組 DNA, 進行 PCR PCR產物送測序 比對測序結果，初步確認TALEN活性 續(xù)上 大于 53%（每 100個細胞中有53個細胞發(fā)生堿基突變） PCR產物 TA克隆、單克隆測序確定打靶效率 續(xù)上 2022/5/31 最終挑選出陽性單細胞克隆，擴增，保存，穩(wěn)定遺傳系建立成功 消化細胞呈單細胞，接種于96孔板中，待單細胞克隆長大后，同上進行鑒定 部分單細胞克隆測序結果： 單克隆鑒定結果表明：基因改變類型包括插入和缺失兩種形式，造成基因移碼突變，成功構建穩(wěn)轉系。 挑選至少 50個單克隆測序 , ，鑒定出雙拷貝敲
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