【正文】 library: 172 CMV, EF1a, Ubi, 35S, T7, SP6 Maximum RVDs: 19 Minimum RVDs: 12 多種 TALEN骨架載體，滿足不同物種需求 第一組載體： 干細(xì)胞 專用打靶載體，采用 EF1α啟動子。 一 切 體 細(xì) 胞 皆 有 可 能 ！ 皮膚成纖維細(xì)胞 骨髓來源細(xì)胞 脂肪干細(xì)胞 毛囊間充質(zhì)干細(xì)胞 腸上皮細(xì)胞 尿液細(xì)胞 ....... Oct4 Sox2 Klf4 Cmyc TALEN 技術(shù) iPS細(xì)胞 基因敲除 iPS細(xì)胞 定點修復(fù) iPS細(xì)胞 定向分化 體外研究：疾病模型建立 。 挑選至少 50個單克隆測序 , ，鑒定出雙拷貝敲除的單克隆 續(xù)上 Knockin 載體構(gòu)建 構(gòu)建 knockin同源重組載體 WT Donor ?提高同源重組效率 ?同源臂構(gòu)建簡單， 5001000bp ?利用抗性基因快速進(jìn)行篩選 打靶示意圖（基因敲入） Dirk Hockemeyer, Haoyi Wang, Samira engineering of human ES and iPS cells using TALE nucleases,Nat Biotechnol. 。 Spacer 1221bp 5’ 5’ 3’ 3’ TALEN連接 ， 選擇模塊 ， 進(jìn)行連接 45h完成 ? 轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞 ? 在 Kana+ LB平板中培養(yǎng) 細(xì)菌轉(zhuǎn)化 挑單克隆， 細(xì)菌培養(yǎng) ? 挑 512 個克隆 （連接效率 ≈ 50%） ? Kana+ LB培養(yǎng)液 單克隆菌落 將單菌落接入含5ml Ka+的 LB培養(yǎng)液的試管中 DNA質(zhì)粒抽提，酶切鑒定 ? DNA質(zhì)粒小抽提 ? 使用 BamHI+PstI雙酶切，植物載體采用 BamHI+SpeI target: 15 nt target: 18 nt 左臂 右臂 1kb Marker 1 kb Marker Digestion Digestion Asssembly length: 15x102=1530 Asssembly length: 18x102=1836 On backbone: 531 Total length: 1530+531=2061 On backbone: 531 Total length: 1836+531=2367 1個單模塊（由 34個氨基酸 — 102個堿基組成）識別一個堿基 ? 上游引物 : 5’CTCCCCTTCAGCTGGACAC3’ ? 下游引物 : 5’AGCTGGGCCACGATTGAC3’ 質(zhì)粒測序 測序結(jié)果比對 標(biāo)準(zhǔn)序列 測序結(jié)果 得到測序正確質(zhì)粒 TALEN 的實際應(yīng)用 DNA水平的 基因敲除 DNA水平的 定點插入 DNA水平的 單堿基修飾 （點突變） ?建立基因敲除 /敲入的真核細(xì)胞系 ?建立基因敲除 /敲入的真核生物模型 DNA水平的miRNA敲除 應(yīng)用實例 1 細(xì)胞模型 Hela細(xì)胞中 XX基因敲除的穩(wěn)轉(zhuǎn)系建立： 項目執(zhí)行時長 2個月 設(shè)計 TALEN識別序列； 構(gòu)建 TALEN載體； 測序驗證 質(zhì)粒正確性 實驗流程： 序列 100%正確 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染入 Hela細(xì)胞中；puromycin藥物篩選 3天 收集篩選后剩余的部分細(xì)胞，抽提基因組 DNA, 進(jìn)行 PCR PCR產(chǎn)物送測序 比對測序結(jié)果，初步確認(rèn)TALEN活性 續(xù)上 大于 53%（每 100個細(xì)胞中有53個細(xì)胞發(fā)生堿基突變） PCR產(chǎn)物 TA克隆、單克隆測序確定打靶效率 續(xù)上 2022/5/31 最終挑選出陽性單細(xì)胞克隆，擴(kuò)增，保存，穩(wěn)定遺傳系建立成功 消化細(xì)胞呈單細(xì)胞，接種于96孔板中，待單細(xì)胞克隆長大后，同上進(jìn)行鑒定 部分單細(xì)胞克隆測序結(jié)果： 單克隆鑒定結(jié)果表明：基因改變類型包括插入和缺失兩種形式，造成基因移碼突變，成功構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)系。 藥物篩選 疾病模型 — 用于疾病機(jī)理研究 ips細(xì)胞系 基因敲除的 ips細(xì)胞系 不同組織 研究基因功能及和疾病的影響 TALEN技術(shù) 定向分化 病人樣本 APOB: 缺失