【文章內(nèi)容簡介】 ? 疏水基團 如不同鏈長的烷烴（ C8和 C18）和苯基等 ? 極性基團 如氨丙基 ， 氰乙基 、 醚和醇等 。 SiOOHSiOOHSiOOH固定相表面C H Si Cl1 8 3 7 3SiOOSiOOSiOO固定相表面CH1 8 3 7Si60 類型 分離方式 應(yīng)用特點 C18 反相、離子對 普適性好，保留值大。溶于水的高極性化合物、中等極性化合物 C8 反相、離子對 與 C18類似，保留值略小 C3,C4 反相 保留值小，適合肽類和蛋白質(zhì) 苯基 反相 保留適中，選擇性不同。非極性、中等極性化合物 CN 反相、正相 選擇性與硅膠類似，保留小，用途廣 NH2 反相、正相、離子交換 分離糖類、核苷酸、固醇等 二醇基 正相 分離有機酸、排阻分蛋白質(zhì)等 醚基 反相、正相 分離酚類、芳硝基化合物，保留比 C18強 聚苯乙烯基 反相 PH使用范圍廣，對部分分離峰形好，壽命長 常用固定相 61 62 ? 不同廠商固定相的比較 63 3. 流動相 ? 溶劑具有穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì) ? 溶劑的選擇與使用的檢測器要有相容性 ? 溶劑的粘度要小 ? 溶劑的沸點不能太低 ? 溶劑的純度要高且價格便宜 ?正相：正己烷、正庚烷、乙醚、二氯甲烷、氯仿等，己烷為主體，加入質(zhì)子接受體乙醚或甲基叔丁基醚，質(zhì)子給予體氯仿，偶極溶劑二氯甲烷 ?反相：水、甲醇、乙腈、四氫呋喃、乙醇及其混合物等，以水為主體，加入質(zhì)子接受體甲醇，質(zhì)子給予體乙腈，偶劑溶劑四氫呋喃。 64 4. 影響保留值的因素 ? 溶質(zhì)結(jié)構(gòu)對保留值的影響： – 正相：溶質(zhì)極性越強，官能團越多，保留值越大 – 反相：溶質(zhì)極性越弱，疏水性越強，保留值越大。溶質(zhì)的保留值與其分子非極性部分的總面積有關(guān)，面積大，保留值大。 65 66 ? 烷基鍵合固定相特性對保留值的影響： – 反相：鍵合相烷鏈長， k大，選擇性好。 67 ? 溶劑性質(zhì)： – 正相：溶劑極性越弱，保留越大 – 反相：流動相表面張力大、介電常數(shù)大，則極性越強。其斥力越大，溶質(zhì)與固定相鍵合越強，保留值越大。 68 ? 鹽的影響： – 通常加入醋酸鹽、硼酸鹽、硫酸鹽等。無機鹽使流動相表面張力增大，對非離子性溶質(zhì)，使 k增加，對離子型溶質(zhì)， k下降。對堿性有機物有改善峰形的作用。 ? pH值： – 加入酸、堿或緩沖液，控制 PH，抑制溶質(zhì)的離子化，改善峰形。用于分析弱酸、堿。 69 5 應(yīng)用 70 二 .液固色譜法 Liquid Solid Chromatography 1. 固定相 極性： 硅膠 、氧化鎂、氧化鋁等 非極性：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等 2. 流動相 硅膠為固定相時：以弱極性的正構(gòu)烷烴為主體，加入二氯甲烷等中等極性溶劑調(diào)節(jié)合適的洗脫強度。 可用水對硅膠進行減活處理，或加入四氫呋喃、乙腈、甲醇、異丙醇等改性劑 71 3. 影響保留值的因素 ? 樣品分子結(jié)構(gòu) – 溶質(zhì)分子的官能團極性增加，保留值增加 – 溶質(zhì)分子的官能團數(shù)目增加，保留值增加 – 保留值與溶質(zhì)的空間效應(yīng)有關(guān) – 保留值與吸附中心的幾何分布有關(guān) ? b．吸附劑 – 吸附劑的孔徑越小，表面積越大，保留值越大 – 吸附劑的活性越強，保留值越大，活性由流動相中的含水量來控制 ? c．流動相 72 4. 應(yīng)用 ? 中等分子量的油溶性樣品如油品 、 脂肪 、 芳烴等 ? 不同極性取代基的化合物 ? 結(jié)構(gòu)異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體混合物的分離 73 74 三、離子對色譜法 Ionpair chromatography – 將一種或數(shù)種與樣品離子電荷（ A+）相反的離子 (B)（稱為對離子或反離子）加入到色譜系統(tǒng)流動相中，使其與樣品離子結(jié)合生成弱極性的離子對（中性締合物）的分離方法。多為反相離子對色譜 75 76 77 2. 固定相、流動相和離子對試劑 ? 固定相 多為 C18,C8反相鍵合相 ? 流動相 是以水為主的緩沖液 ， 或水 甲醇 、 水 乙腈等混合溶劑 ? 離子對試劑 ：四丁基銨正離子 、 十六烷基三甲基銨正離子 ， ClO4， 十二烷基磺酸根等 78 3. 影響保留值的因素 ? pH的影響 ： 改善分離選擇性的有效方法。 反相中，對于陰離子的分離， pH下降， k減小。 ? 離子對試劑的性質(zhì)與濃度 ：反相中，離子對試劑烷基鏈越長，疏水性越大， k越大。 ? 溶劑的極性 ： 反相中，甲醇、乙腈等含量增加，洗脫強度增大， k下降。洗脫強度與極性參數(shù)、介電常數(shù)同時相關(guān) ? 離子強度 ：反相中，離子強度增加，溶質(zhì) k下降 79 4. 應(yīng)用 有機酸 、 有機堿特別是強酸 強堿的分析 ， 如羧酸 、 磺酸 、 胺類 、 酚類 、 藥物 、 染料等 反相離子對色譜分析有機酸 固定相： C18烷基鍵合相 流動相： +戊醇 1. 4氨基苯甲酸； 2. 3氨基苯甲酸；3. 4羥基苯甲酸； 4. 3羥基苯甲酸；5. 苯磺酸； 6. 苯甲酸； 7. 甲苯 4磺酸 80 色譜類型 （ Mode） 固定相 （ Stationary Phase） 流動相 (Mobile Phase) 主要適用范圍 (Compound Sepatated) 正相色譜 （ NormalPhase） 硅膠 、氰基、氨基 有機溶劑 在水中絕對不溶解的物質(zhì)或同分異構(gòu)體 反相色譜色譜 (ReversedPhase) C18,C8,C4,C2 水 /有機溶劑 中性、弱酸性、弱堿性物質(zhì) 離子對色譜 (IonPair) C18,C8 水 /有機溶劑 離子對試劑 離子 離子交換色譜 (Ion Exchange) 陰離子和陽離子交換劑 水相 /緩沖鹽 對離子 離子 體積排阻色譜 (Size Exclusion) 聚酯、硅膠 水相 (GPC) 有機相 (GPC) 大分子量化合物 聚合物 液相色譜常用類型總結(jié)： 81 第 3章 高效液相色譜法的建立與應(yīng)用 82 我國藥典收載高效液相色譜法項目和數(shù)量比較表： 83 高效液相色譜儀的分析原理 ? 高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu) ? 色譜柱在高效液相色譜儀中的作用和峰形產(chǎn)生原理 高壓泵 進樣器 檢測器 色譜工作站 色譜柱 84 HPLC有以下特點 ? 高壓 ——壓力可達 150~300 Kg/cm2。 色譜柱每米降壓為 75 Kg/cm2以上 。 ? 高速 ——流速為 ~ ml/min。 ? 高效 ——可達 10000塔板每米 。 在一根柱中同時分離成份可達 100種 。 ? 高靈敏度 ——紫外檢測器靈敏度可達 。同時消耗樣品少 。 85 HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點： ? 速度快 ——通常分析一個樣品在 15~30 min， 有些樣品甚至在 5 min內(nèi)即可完成 。 ? 分辨率高 ——可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果 。 ? 靈敏度高 ——紫外檢測器可達 ， 熒光和電化學(xué)檢測器可達 。 ? 柱子可反復(fù)使用 ——用一根色譜柱可分離不同的化合物 。 ? 樣品量少，容易回收 ——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。 86 ? In which materials ? ? In what concentration ? ? Which sample ? ? With which technique ? 一 .高效液相色譜法的建立 87 – What is the sample ? – Concentration of the interested ponent – Contaminant – Characteristics of the sample – Structure – Molecular weigh