【文章內(nèi)容簡介】 其產(chǎn)物在不同時間、空間、條件的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及活動規(guī)律 功能基因組學(xué) ?從整體角度分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分；表達(dá)水平（定量）；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及修飾狀態(tài)（三維結(jié)構(gòu)、活性部位）；蛋白質(zhì)之間的相互作用（蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)） 蛋白質(zhì)組學(xué) ?通過對核苷酸序列、基因組的大小、基因數(shù)量多少、特定基因的存在與缺失、基因的位置及排列順序等進(jìn)行比較研究，探討物種的進(jìn)化、基因功能演變和基因調(diào)控。 比較基因組學(xué) ?研究人類疾病與環(huán)境因素相關(guān)的易感基因及其產(chǎn)物，闡明其對環(huán)境暴露的遺傳性反應(yīng)分子機(jī)制。 環(huán)境基因組學(xué) ?人類對藥物作用存在個體差異。通過研究疾病相關(guān)基因、藥物作用靶點(diǎn)、藥物代謝酶譜、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因多態(tài)性，闡明影響藥物作用、藥物吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、清除過程中的基因差異。提高藥物療效及安全性 藥物基因組學(xué) 系統(tǒng)生物學(xué) ? 系統(tǒng)生物學(xué) （ systems biology）： 是了解一個生物復(fù)雜系統(tǒng)中所有組成成分（基因、 mRNA、蛋白質(zhì)、代謝小分子等）的構(gòu)成以及在特定條件下這些組分間的相互關(guān)系，并分析該系統(tǒng)在一定時間內(nèi)的動力學(xué)過程。 生物信息學(xué) ? 生物信息學(xué) （ Bioinformatics） ： 是在生命科學(xué)的研究中，以計(jì)算機(jī)為工具對生物信息進(jìn)行儲存、檢索和分析的科學(xué)。是 21世紀(jì)自然科學(xué)的核心領(lǐng)域之一。其研究重點(diǎn)主要體現(xiàn)在基因組學(xué)和蛋白學(xué)。 第四章 蛋白質(zhì)組與蛋白組學(xué) proteome and proteomics DNA mRNA 蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)錄 翻譯 基因 蛋白質(zhì) 細(xì)胞特異性基因表達(dá) 生理狀態(tài) 蛋白質(zhì)相互作用 溫度 應(yīng)激狀態(tài) 培養(yǎng)條件 藥物作用 數(shù)量有限 結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定 復(fù)雜性 多變性 直接反應(yīng)生命現(xiàn)象 復(fù)雜的調(diào)控 蛋白質(zhì)組（ proteome） ?概念：意指 ―proteins expressed by a genome‖，即 ―一個細(xì)胞或一個組織基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì) ‖。這是一個在時間和空間上動態(tài)變化著的整體。 蛋白質(zhì)組 protein + genome proteome 一種基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì) 一個細(xì)胞或一個機(jī)體的基因所表達(dá)的全部蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)組與基因組的差別 蛋白質(zhì)組隨著組織、甚至環(huán)境狀態(tài)的不同而改變。在轉(zhuǎn)錄時，一個基因可以多種 mRNA形式剪接，并且，同一蛋白可能以許多形式進(jìn)行翻譯后的修飾。故一個蛋白質(zhì)組不是一個基因組的直接產(chǎn)物，蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)目有時可以超過基因組的數(shù)目。 蛋白質(zhì)組學(xué)（ proteomics） 概念：是指應(yīng)用各種技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)組的一門新興學(xué)科 . 目的：從整體角度分析細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分；表達(dá)水平（定量）；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及修飾狀態(tài)（三維結(jié)構(gòu)、活性部位）；蛋白質(zhì)之間的相互作用（蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)） 功能蛋白質(zhì)組學(xué) （ functional proteomics） ?功能蛋白質(zhì)組指細(xì)胞在一定階段或與某一生理現(xiàn)象相關(guān)的所有蛋白質(zhì)，這一群體可大可小，最終將多個功能亞群體組合起來，逐步描繪出接近生命細(xì)胞的 ―全部蛋白質(zhì) ‖的蛋白質(zhì)組圖譜。 ?目前，蛋白組學(xué)的研究主要把目標(biāo)定位在功能蛋白質(zhì)組學(xué) 蛋白組學(xué)研究的意義 (1)生命現(xiàn)象的發(fā)生往往是多因素影響的，必然涉及到多個蛋白質(zhì)。 (2)多個蛋白質(zhì)的參與是交織成網(wǎng)絡(luò)的，或平行發(fā)生，或呈級聯(lián)因果。 (3)在執(zhí)行生理功能時蛋白質(zhì)的表現(xiàn)是多樣的、動態(tài)的，并不像基因組那樣基本固定不變。 因此要對生命的復(fù)雜活動有全面和深入的認(rèn)識，必然要在整體、動態(tài)、網(wǎng)絡(luò)的水平上對蛋白質(zhì)進(jìn)行研究。 蛋白組學(xué)研究的特點(diǎn) ? 整體性 ：基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)；各種蛋白質(zhì)其各自功能的發(fā)揮依賴于整體性；研究的策略要求整體性。 ? 動態(tài)性 ：同一機(jī)體的不同組織和細(xì)胞、不同發(fā)育階段；機(jī)體在不同生理和病理狀態(tài)下的表達(dá)差異。 ? 復(fù)雜性 ： mRNA的轉(zhuǎn)錄水平并不能代表蛋白質(zhì)表達(dá)水平；蛋白的多樣性和復(fù)雜性更多體現(xiàn)在翻譯后修飾。 蛋白組學(xué)研究的內(nèi)容 蛋白質(zhì)組學(xué)集中于動態(tài)描述基因調(diào)節(jié)，對 基因表達(dá)的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行分離、分析與鑒定、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析、生理與病理狀態(tài)或不同發(fā)育階段蛋白質(zhì)組表達(dá)差異的研究，解釋蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)的機(jī)制。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)路線 第一節(jié) 蛋白質(zhì)組 分離分析技術(shù) 一、蛋白質(zhì)分離純化的一般程序 生物體組織細(xì)胞 離心技術(shù) 鹽析法 親和層析 凝膠層析 離子交換層析 電泳法 純化蛋白 材料選擇 細(xì)胞破碎 有機(jī)溶劑沉淀法 等電點(diǎn)法 （一）蛋白質(zhì)樣品的制備 ? 勻漿組織 ：組織勻漿后不同細(xì)胞類型的蛋白質(zhì)混雜在一起，最后得到的研究數(shù)據(jù)根本無法解釋蛋白質(zhì)在每類細(xì)胞中的表達(dá)情況，因此其研究結(jié)論值得懷疑。 ? 培養(yǎng)細(xì)胞 ：可以得到單一類型細(xì)胞，但體外培養(yǎng)很難模擬體內(nèi)細(xì)胞的環(huán)境，因此其結(jié)論也很難用于解釋體內(nèi)實(shí)際情況。 ? LCM技術(shù)粘取細(xì)胞 ：能從復(fù)雜組織中選取特定的單一細(xì)胞用于研究，客觀地反映發(fā)生在生物細(xì)胞中的真實(shí)變化。 LCM技術(shù) LCM稱激光顯微捕獲系統(tǒng)，其核心是用 近紅外激光熔化一種特殊的膠膜來粘取細(xì) 胞。能從復(fù)雜組織中選取特定的單一細(xì)胞 用于研究，使分子生物學(xué)的研究更加準(zhǔn)確 ，精細(xì)，客觀地反映發(fā)生在生物細(xì)胞中的 真實(shí)變化。 （二）鹽析法 ? 根據(jù)不同蛋白質(zhì)在一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達(dá)到彼此分離的方法 ? 鹽析 （ salting in）：蛋白質(zhì)在低鹽濃度下的溶解度隨著鹽濃度的升高而增加。這是由于少量鹽類離子與水分子影響蛋白質(zhì)分子上的極性基團(tuán)，使其溶解度增大。 ? 鹽析 （ salting out）：當(dāng)鹽濃度增加到一定程度時，蛋白質(zhì)表面的電荷被大量中和，水化膜被破壞，蛋白質(zhì)分子相互聚集而沉淀析出。 （三）電泳技術(shù) ? 原理 ：利用蛋白質(zhì)分子所帶電荷不同或分子大小及形狀不同，在外界電場的作用下，蛋白質(zhì)帶電粒子在電場中具有不同的泳動速率而進(jìn)行的分離。 ? 電泳介質(zhì) ：聚丙烯酰胺凝膠、緩沖液 ? 電泳類型 ：板狀或管狀聚丙烯酰胺凝膠電泳 /毛細(xì)管電泳；分析型凝膠電泳 /制備型凝膠電泳 （四）層析技術(shù) ? 又稱 分子篩層析 ? 是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物的最有效方法之一 ? 常用的分子篩填充物： 葡聚糖凝膠 、瓊脂糖凝膠。凝膠顆粒形成不同交聯(lián)度的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 ? 分離原理：不同分子大小的蛋白質(zhì)在重力作用下通過凝膠顆粒，不能進(jìn)入“網(wǎng)眼”的大分子蛋白由于路徑較短首先被洗脫出來；小分子蛋白能進(jìn)入“網(wǎng)眼”路徑較長則后被洗脫出來。 凝膠過濾層析 ? 填充劑 ：離子交換樹脂（劑），分為陰離子交換劑（帶正電荷，能結(jié)合陰離子）、陽離子交換劑（帶負(fù)電荷，能結(jié)合陽離子） ? 原理 ：帶電荷的蛋白質(zhì)由于所帶電荷數(shù)不同，對交換劑的親和力出現(xiàn)差異，通過離子交換與洗脫，使不同的離子先后被洗脫下來，達(dá)到分離的目的。 離子交換層析： ? 原理 ：利用生物大分子具有與其結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的分子（酶 底物、抗原 抗體、配體 受體、生物素 親和素等）發(fā)生可逆性特異結(jié)合的特性達(dá)到專一的分離。 ? 固定相 ：結(jié)合有親和物的不溶于水的固相支持物 ? 流動相 ：含有與親和物匹配的待分離物緩沖液。先用流動相洗去雜質(zhì)，再用特殊流動相解離待分離蛋白。 親和層析： 第二節(jié) 蛋白質(zhì)組 鑒定分析技術(shù) （一） Western印跡雜交 基本操作步驟： 蛋白樣品的制備 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳 蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移 蛋白質(zhì)與抗體的結(jié)合反應(yīng) 目標(biāo)蛋白質(zhì)的顯示 western 印跡基本步驟圖示 （二）雙向凝膠電泳 （ twodimensional gel electrophoresis， 2DE） ? 雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組研究中最有效的分析鑒定技術(shù)之一 。它是由 O Farrell’s于 1975年首次建立并成功地分離約 1 000個 ，并表明蛋白質(zhì)譜不是穩(wěn)定的，而是隨環(huán)境而變化。目前，隨著技術(shù)的飛速發(fā)展，二維電泳技術(shù)已能分離出 10 000個斑點(diǎn) (spot)。 雙向電泳原理 ?由兩向電泳組成 ?第一向是以蛋白質(zhì)電荷差異基礎(chǔ)進(jìn)行分離的等電聚焦凝膠電泳 ?第二向是以蛋白質(zhì)分子量差異為基礎(chǔ)的沿垂直方向進(jìn)行的 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。 2DE 技術(shù)原理 等電聚焦凝膠電泳 （ isoelectric focusing gel electrophoresis， IEF） 在等點(diǎn)聚焦過程中，載體兩性電解質(zhì)在電場中形成正極為酸性、負(fù)極為堿性的連續(xù)pH梯度。帶電荷的蛋白分子在連續(xù) pH梯度中電泳，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移到其等電點(diǎn)位置時，凈電荷為零，在電場中不再移動，由此可分離各種不同等電點(diǎn)性質(zhì)的蛋白質(zhì)。 固相 pH梯度等電聚焦 （ immobilized pH gradients isoelectric focusing,IPGIEF） ? 1988年 G A建立的一種新型等電聚焦凝膠電泳 ? 所用介質(zhì)為具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，為一種固定化電解質(zhì)，在凝膠聚合時形成 pH梯度，不隨環(huán)境電場的改變而改變 ? 比傳統(tǒng)的 IEF具有更高的分辨率（可達(dá)），上樣量大，預(yù)制的商品化IPG膠條易于自動化操作、結(jié)果重復(fù)性好 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 十二烷基硫酸鈉（ SDS）是一種陰離子去污劑，能與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)相結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)獲得大量的負(fù)電荷