疫化學(xué)技術(shù)ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-28 18:10 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 A，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。 脂類(lèi)物質(zhì) 無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入 ELISA板孔中，開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。 優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳?？乖昧可?，僅為直接包被的 1/10乃至于 /100。 包被用抗原： 天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類(lèi)。 合成多肽抗原 是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。 包被用抗體 IgG對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在 Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外。 取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液 .須除去雜抗體后才能用于 ELISA，以保證試驗(yàn)的特異性。 腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。 包被的條件 pH78的 TrisHCL緩沖液。 加入包被液后，在 48℃ 冰箱中放置過(guò)夜， 37℃ 中保溫 2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為 10ng/ml20ug/ml。 封 閉 封閉 (blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥 ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。 常用封閉劑： %%的 BSA。 10%的小牛血清或 1%明膠 。脫脂奶粉 ,比較價(jià)廉，可以高濃度使用（ 5%）。 所有的 ELISA固相均需封閉？ 洗滌液 在板式 ELISA中，常用的稀釋液為含 %吐溫20磷酸鹽緩沖液。 ELISA的試劑準(zhǔn)備 B 結(jié)合物 即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是 ELISA中關(guān)鍵的試劑 1 酶的催化活性 2 抗體（或抗原）的免疫活性 3 含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4 結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。 ? 結(jié)合物用的抗原和抗體 制備結(jié)合物時(shí)所用純度較高的 IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。在 ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。 ? 酶 純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專(zhuān)一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。 酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。 在 ELISA中， HRP， AP，葡萄糖氧化酶， β D半乳糖苷酶和脲酶等。 HRP是一種糖蛋白，含糖量約為 18%，分子量為 44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。 ? 結(jié)合物的制備 酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。 （ 1） 戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達(dá) 60%70%）和重復(fù)性好。 交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。 （ 2）過(guò)碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成 chiff氏堿而 結(jié)合。簡(jiǎn)便有效 . 結(jié)合物中混有的 游離酶 一般不影響 ELISA中最后的酶活性測(cè)定。但游離的 抗體 則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè)，效果更好。 制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè) 低的本底 ，并獲得測(cè)定的最佳靈敏度，達(dá)到最合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。 ? 結(jié)合物的保存 酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（ HRP結(jié)合物加硫柳泵， AP結(jié)合物可加疊氮鈉）。 ? 結(jié)合物的稀釋液 用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上： %牛血清白蛋白， %吐溫 20 。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時(shí)不需再行稀釋?zhuān)?48℃ 保存期可達(dá) 6個(gè)月。 試劑準(zhǔn)備 C 酶的底物 酶的底物 HRP的底物 OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是 HRP結(jié)合
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