《疫化學(xué)技術(shù)》ppt課件-預(yù)覽頁
【正文】 行 酶催化反應(yīng) 根據(jù)顏色反應(yīng)的 程度進(jìn)行該抗原 的定性或定量測(cè)定 雙抗體夾心法測(cè)抗原 此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如 HBsAg、 HBeAg、 AFP等。 C. 加酶標(biāo)抗體 。 ，則結(jié)合 為抗原抗體復(fù)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。 （二）間接法 酶 抗抗體 酶標(biāo)記 抗抗體 抗體 抗原 固相載體 。 間接法（抗 HCV等）示意圖 間接法測(cè)抗體 傳染病的診斷。 B. 加入酶標(biāo)抗原和待測(cè)抗原 ， 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體； 對(duì)照只加入酶標(biāo)抗原； C. 加底物 。因此，加入底物后顯色反應(yīng)較弱。 ? 常用的發(fā)光試劑有魯米諾（ luminol)和光澤精 (lucigenin)。 ELISA實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對(duì)其進(jìn)行定量。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。 脂類物質(zhì) 無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入 ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。 合成多肽抗原 是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。 取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液 .須除去雜抗體后才能用于 ELISA，以保證試驗(yàn)的特異性。 加入包被液后，在 48℃ 冰箱中放置過夜， 37℃ 中保溫 2小時(shí)。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥 ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。 所有的 ELISA固相均需封閉？ 洗滌液 在板式 ELISA中，常用的稀釋液為含 %吐溫20磷酸鹽緩沖液。在 ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。 HRP是一種糖蛋白，含糖量約為 18%，分子量為 44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。 交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。但游離的 抗體 則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè)，效果更好。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時(shí)不需再行稀釋，在 48℃ 保存期可達(dá) 6個(gè)月。 DH2如：鄰苯二胺 (OPD)、 四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)和 ABTS 。 ABTS雖不如 OPD和 TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。用 NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。 陽性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。 5 標(biāo)本的采取和保存 體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。 加樣 : 在 ELISA中一般有 3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。為什么 ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？ 溫育常采用的溫度有 43℃ 、 37℃ 、室溫和 4℃ （冰箱溫度）等。反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。 洗滌 洗滌在 ELISA過程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。 可以說在 ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。 顯色 顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。 TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。 以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。 酶標(biāo)比色儀 酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀 ELISA光度計(jì)。 1%，重復(fù)性達(dá) %。 各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說明書。 在間接法和夾心法 ELSIA中， 陽性孔 呈色深于陰性孔。 /陰性對(duì)照比值：在實(shí)驗(yàn)條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適。 測(cè)定大分子量物質(zhì)的夾心法 ELISA，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬，曲線的值逐點(diǎn)連接，所得曲線一般呈 S形，其頭、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是最理想的檢測(cè)區(qū)域。 農(nóng)藥的檢測(cè) ： ELISA檢測(cè) “ 非典型肺炎 ” 冠狀病毒 ELISA在結(jié)締組織病早期診斷中的應(yīng)用檢測(cè)抗異質(zhì)性胞核核糖蛋白 A2（ hnRNPA2） /類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（ PtA） 33抗體 ELISA在疾病診斷中的作用 ELISA法檢測(cè)幽門螺桿菌抗體 ELISA試劑盒商業(yè)資訊 ELISA試劑盒 酶聯(lián)免疫
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