疫化學(xué)技術(shù)ppt課件(已修改)
2025-05-13 18:10 本頁面
【正文】 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng) (Enzymelinked Immunosorbent Assay,ELISA) 免疫標(biāo)記技術(shù) 放射物標(biāo)記技術(shù) 酶標(biāo)技術(shù) 免疫熒光技術(shù) 其他標(biāo)記技術(shù) 酶聯(lián)免疫吸附技術(shù) 酶免疫組化技術(shù) 雙抗體夾心法 競 爭 法 雙抗原夾心法 間 接 法 雙位一點法 什么是 酶聯(lián)免疫分析技術(shù) ELISA的基本原理和方法 ELISA的種類和變化 ELISA的特點 ELISA的應(yīng)用實例 一、基本原理 是利用抗原抗體進行的檢測技術(shù)。即利用制備好的特異抗原或抗體作為試劑，以檢測標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原。 在這種測定方法中有 3種必要的試劑： ①固相的抗原或抗體（ 免疫吸附劑） ②酶標(biāo)記的抗原或抗體（ 標(biāo)記物） ③酶作用的底物（ 顯色劑） ELISA原理 ?使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性 ?使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性 ?結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān) 其所生成的顏色深淺與欲測的 抗原（抗體）含量成正比。 這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計（酶標(biāo)儀）加以測定。 其方法簡單，方便訊速，特異性強。 二、酶及其底物 酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原 , 半抗原在交聯(lián)劑作用下聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。是 ELISA成敗的關(guān)鍵試劑，它不僅具有抗體抗原特異的免疫反應(yīng)，還具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用，但不同的酶選用不同的底物 ，將得到不同的顏色反應(yīng) . 酶 底 物 顯色反應(yīng) 測定波長 辣根過氧化物酶 鄰苯二胺 四甲替聯(lián)苯胺 氨基水楊酸 鄰聯(lián)苯甲胺 2,2‘連胺基 2(3乙基 并噻唑啉磺酸 6)銨鹽 橘紅色 黃色 棕色 蘭色 藍(lán)綠色 492 460 449 425 642 堿性磷酸酯酶 4硝基酚磷酸鹽 (PNP) 萘酚 ASMx磷酸鹽 +重氮鹽 黃色 紅色 400 500 葡萄糖氧化酶 ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖 +甲硫酚嗪 +噻唑蘭 黃色 深藍(lán)色 405 420 β Ｄ－半乳糖苷酶 甲基傘酮基半乳糖苷 (4MuG) 硝基酚半乳糖苷 (ONPG) 熒光 黃色 360,450 420 ELISA的種類和變化 （一）雙抗體夾心法 （二）間接法 （三）競爭法 （四）雙位點一步法 （五）捕獲法測 IgM抗體 （六）應(yīng)用親和素和生物素的 ELISA （一）雙抗體夾心法 此法適用于 檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原 雙抗體夾心法（ HBsAg、 HBeAg等）示意圖 固相載體 抗體 抗原 酶 抗體 酶標(biāo)記抗體 。 ，則結(jié)合 為抗原抗體復(fù)合物。 ，則結(jié)合 為抗體 抗原 酶標(biāo)記抗體復(fù)合 物。 。 獲得待分析物的未標(biāo)定抗體 將特異性抗體與固相 載體連接形成固相抗體 洗滌除去未結(jié)合的 抗體及雜質(zhì) 加入封閉蛋白溶液以封閉載體 表面殘留的蛋白結(jié)合位點 洗滌并除去未結(jié)合的封閉蛋白 加受檢標(biāo)本（抗原）形成 固相抗體－抗原復(fù)合物 洗滌除去其他 未結(jié)合的物質(zhì) 加酶標(biāo)抗體生成 抗體 — 待測抗原 — 酶標(biāo)記抗體 的復(fù)合物 徹底洗滌 未結(jié)合的 酶標(biāo)抗體 加底物進行 酶催化反應(yīng) 根據(jù)顏色反應(yīng)的 程度進行該抗原 的定性或定量測定 雙抗體夾心法測抗原 此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如 HBsAg、 HBeAg、 AFP等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于 包被固相載體 和制備 酶結(jié)合物 而建立此法。 （ 1） 雙抗體夾心法測定抗原 A. 將抗體吸附于固相表面 。 B. 加抗原 ， 形成抗原 抗體復(fù)合物 。 C. 加酶標(biāo)抗體 。 E. 加底物。底物的降解量＝抗原量。 雙抗原夾心法（抗 HBs等）示意圖 。 ，則結(jié)合 為抗原抗體復(fù)合物。 ，則結(jié)合 為抗原 抗體 酶標(biāo)記抗原復(fù)合 物。 。 酶 抗原 酶標(biāo)記 抗原 抗體 抗原 固相載體 雙抗原夾心法測抗體 用特異性抗原進行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗 HBsAg的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合
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