【文章內(nèi)容簡介】 D8 siR N AsCD8 m RNA5 ’ UTR C D 4 O R F 3 ’ UTRCD4 m RNACD4 siR N Ascan any r egion of the m RN A be tar geted with siR NA s ?++M cM a n u s, 2 0 0 2P B 2P B 1PANPMNSU T R5 ’ 3 ’C o d i n g se q u e n c eN o in h i b i tio nP a r tia l in h i b i ti o nS tr o n g i n h i b i tio nsi R N AIn f l u e n za mRN A t a rg e t s i t e sGe , 2 0 0 3陰性對照 ? 一個完整的 siRNA實驗應該有陰性對照，作為陰性對照的 siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成， 但是和 mRNA沒有明顯的同源性。 ?通常的做法是將選中的 siRNA序列打亂 ，同樣要 檢查結(jié)果以保證它和目的靶細胞中其他基因沒有同源性 。 目前已證實的 siRNA可以在下面的網(wǎng)頁找到 px?key=49 ml /jsp/?Category=Published siRNA的制備 ?通過化學合成 ?體外轉(zhuǎn)錄 ?長片斷 dsRNAs經(jīng) RNase III 類降解 (. Dicer, E. coli, RNase III)體外制備 siRNA ?通過 siRNA表達載體或者病毒載體， PCR制備的 siRNA表達框在細胞中表達產(chǎn)生siRNA。 ? 許多國外公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學合成 siRNA。 ? 主要的缺點 包括價格高，定制周期長，特別是有特殊需求的。 ? 由于價格比其他方法高，為一個基因合成 3—4對 siRNAs的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。 ? 最適用于 ：已經(jīng)找到最有效的 siRNA的情況下，需要大量 siRNA進行研究 ? 不適用于 ：篩選 siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素 ? 以 DNA Oligo為模版，通過體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs，成本相對化學合成法而言比較低，而且能夠比化學合成法更快的得到 siRNAs。 ? 不足之處 是實驗的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的 siRNAs，但是反應規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比，還是需要占用研究人員相當?shù)臅r間。 ? 優(yōu)點 ：體外轉(zhuǎn)錄得到的 siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學合成的 siRNA量的1/10就可以達到化學合成 siRNA所能達到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。 ? ?最適用于 ：篩選 siRNAs，特別是需要制備多種 siRNAs，化學合成的價格成為障礙時。 ?不適用于 ：實驗需要大量的，一個特定的 siRNA。長期研究。 RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備 siRNA ?選擇通常是 200—1000堿基的靶 mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA ，然后用 RNaseIII (or Dicer)在體外消化，得到一種 siRNAs“混合雞尾酒”。 ?在除掉沒有被消化的 dsRNA后，這個siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細胞，方法和單一的 siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于 siRNA混合物中有許多不同的 siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。 ?主要優(yōu)點 ：可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時間和金錢（注意：通常用 RNAseIII通常比用 Dicer要便宜）。 ?缺點 ：有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關的基因。 現(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常不會造成影響。 ?最適用于 ：快速而經(jīng)濟地研究某個基因功能缺失的表型 ? 不適用于 ：長時間的研究項目，或者是需要一個特定的 siRNA進行研究，特別是基因治療 ?體內(nèi)表達 ?采用 siRNA表達載體和基于 PCR的表達框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細胞的 DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到 siRNAs。 這兩種方法的優(yōu)點在于不需要直接操作 RNA。 4. siRNA表達載體 ? 多數(shù)的 siRNA表達載體依賴三種 RNA聚合酶 III 啟動子 (pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。 ? 這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的 U6啟動子和人 H1啟動子。 ? 之所以采用 RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子 RNA，而且它是通過添加一串（ 3到 6個） U來終止轉(zhuǎn)錄的。 ?要使用這類載體，需要訂購 2段編碼短發(fā)夾 RNA序列的 DNA單鏈，退火，克隆到相應載體的 pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾周甚至數(shù)月的時間，同時也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的 ?siRNA表達載體的優(yōu)點 在于可以進行較長期研究 ——帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因的表達，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。 ? 病毒載體 也可用于 siRNA表達，其優(yōu)勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來的種種不便 ,而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。 ?最適用于：已知一個有效的 siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默。 ?不適用于：篩選 siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作）。 len ti v iral c o n s tr u c t for s iR N A s5. SiRNA表達框架 ? SiRNA表達框架 (siRNA expression cassettes， SECs)是一種由 PCR得到的siRNA表達模版，包括一個 RNA polIII啟動子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu) siRNA，一個 RNA polIII終止位點，能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。 ?和 siRNA表達載體不同的是， SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由 PCR得到，不用一天的時間。 ?SECs成為篩選 siRNA的最有效工具 ，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和 siRNA的最適搭配。 ?如果在 PCR兩端添加酶切位點 ，那么通過 SECs篩選出的最有效的 siRNA后，可以 直接克隆到載體中構(gòu)建 siRNA表達載體 。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達 siRNA和長效抑制的研究。 ?主要缺點： ?① PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細胞中（晶賽公司的 Protocol可以解決這一問題） ?②不能進行序列測定， PCR和 DNA合成時可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導致結(jié)果不理想。 ?最適用于：篩選 siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子 ? ?不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了） 比較項目 化學合成 體外轉(zhuǎn)錄 RNase III降解dsRNA siRNA 表達載體 PCR 表達框 材料需求 21mer RNA