rnai及其在抗hiv中的初步應(yīng)用(編輯修改稿)
2025-05-27 08:31 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 D8 siR N AsCD8 m RNA5 ’ UTR C D 4 O R F 3 ’ UTRCD4 m RNACD4 siR N Ascan any r egion of the m RN A be tar geted with siR NA s ?++M cM a n u s, 2 0 0 2P B 2P B 1PANPMNSU T R5 ’ 3 ’C o d i n g se q u e n c eN o in h i b i tio nP a r tia l in h i b i ti o nS tr o n g i n h i b i tio nsi R N AIn f l u e n za mRN A t a rg e t s i t e sGe , 2 0 0 3陰性對(duì)照 ? 一個(gè)完整的 siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對(duì)照，作為陰性對(duì)照的 siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成， 但是和 mRNA沒(méi)有明顯的同源性。 ?通常的做法是將選中的 siRNA序列打亂 ，同樣要 檢查結(jié)果以保證它和目的靶細(xì)胞中其他基因沒(méi)有同源性 。 目前已證實(shí)的 siRNA可以在下面的網(wǎng)頁(yè)找到 px?key=49 ml /jsp/?Category=Published siRNA的制備 ?通過(guò)化學(xué)合成 ?體外轉(zhuǎn)錄 ?長(zhǎng)片斷 dsRNAs經(jīng) RNase III 類(lèi)降解 (. Dicer, E. coli, RNase III)體外制備 siRNA ?通過(guò) siRNA表達(dá)載體或者病毒載體， PCR制備的 siRNA表達(dá)框在細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)生siRNA。 ? 許多國(guó)外公司都可以根據(jù)用戶(hù)要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成 siRNA。 ? 主要的缺點(diǎn) 包括價(jià)格高，定制周期長(zhǎng)，特別是有特殊需求的。 ? 由于價(jià)格比其他方法高，為一個(gè)基因合成 3—4對(duì) siRNAs的成本就更高了，比較常見(jiàn)的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。 ? 最適用于 ：已經(jīng)找到最有效的 siRNA的情況下，需要大量 siRNA進(jìn)行研究 ? 不適用于 ：篩選 siRNA等長(zhǎng)時(shí)間的研究，主要原因是價(jià)格因素 ? 以 DNA Oligo為模版，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成siRNAs，成本相對(duì)化學(xué)合成法而言比較低，而且能夠比化學(xué)合成法更快的得到 siRNAs。 ? 不足之處 是實(shí)驗(yàn)的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的 siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。而且和化學(xué)合成相比，還是需要占用研究人員相當(dāng)?shù)臅r(shí)間。 ? 優(yōu)點(diǎn) ：體外轉(zhuǎn)錄得到的 siRNAs毒性小，穩(wěn)定性好，效率高，只需要化學(xué)合成的 siRNA量的1/10就可以達(dá)到化學(xué)合成 siRNA所能達(dá)到的效果，從而使轉(zhuǎn)染效率更高。 ? ?最適用于 ：篩選 siRNAs，特別是需要制備多種 siRNAs，化學(xué)合成的價(jià)格成為障礙時(shí)。 ?不適用于 ：實(shí)驗(yàn)需要大量的，一個(gè)特定的 siRNA。長(zhǎng)期研究。 RNase III 消化長(zhǎng)片斷雙鏈RNA制備 siRNA ?選擇通常是 200—1000堿基的靶 mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長(zhǎng)片斷雙鏈dsRNA ，然后用 RNaseIII (or Dicer)在體外消化，得到一種 siRNAs“混合雞尾酒”。 ?在除掉沒(méi)有被消化的 dsRNA后，這個(gè)siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法和單一的 siRNA轉(zhuǎn)染一樣。由于 siRNA混合物中有許多不同的 siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。 ?主要優(yōu)點(diǎn) ：可以跳過(guò)檢測(cè)和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節(jié)省時(shí)間和金錢(qián)（注意：通常用 RNAseIII通常比用 Dicer要便宜）。 ?缺點(diǎn) ：有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因。 現(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況通常不會(huì)造成影響。 ?最適用于 ：快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個(gè)基因功能缺失的表型 ? 不適用于 ：長(zhǎng)時(shí)間的研究項(xiàng)目，或者是需要一個(gè)特定的 siRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療 ?體內(nèi)表達(dá) ?采用 siRNA表達(dá)載體和基于 PCR的表達(dá)框架則屬于：從轉(zhuǎn)染到細(xì)胞的 DNA模版中在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到 siRNAs。 這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)在于不需要直接操作 RNA。 4. siRNA表達(dá)載體 ? 多數(shù)的 siRNA表達(dá)載體依賴(lài)三種 RNA聚合酶 III 啟動(dòng)子 (pol III)中的一種，操縱一段小的發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)。 ? 這三類(lèi)啟動(dòng)子包括大家熟悉的人源和鼠源的 U6啟動(dòng)子和人 H1啟動(dòng)子。 ? 之所以采用 RNA pol III啟動(dòng)子是由于它可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子 RNA，而且它是通過(guò)添加一串（ 3到 6個(gè)） U來(lái)終止轉(zhuǎn)錄的。 ?要使用這類(lèi)載體，需要訂購(gòu) 2段編碼短發(fā)夾 RNA序列的 DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的 pol III 啟動(dòng)子下游。由于涉及到克隆，這個(gè)過(guò)程需要幾周甚至數(shù)月的時(shí)間，同時(shí)也需要經(jīng)過(guò)測(cè)序以保證克隆的序列是正確的 ?siRNA表達(dá)載體的優(yōu)點(diǎn) 在于可以進(jìn)行較長(zhǎng)期研究 ——帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。 ? 病毒載體 也可用于 siRNA表達(dá)，其優(yōu)勢(shì)在于可以直接高效率感染細(xì)胞進(jìn)行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來(lái)的種種不便 ,而且轉(zhuǎn)染效果更加穩(wěn)定。 ?最適用于：已知一個(gè)有效的 siRNA序列，需要維持較長(zhǎng)時(shí)間的基因沉默。 ?不適用于：篩選 siRNA序列（其實(shí)主要是指需要多個(gè)克隆和測(cè)序等較為費(fèi)時(shí)、繁瑣的工作）。 len ti v iral c o n s tr u c t for s iR N A s5. SiRNA表達(dá)框架 ? SiRNA表達(dá)框架 (siRNA expression cassettes， SECs)是一種由 PCR得到的siRNA表達(dá)模版，包括一個(gè) RNA polIII啟動(dòng)子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu) siRNA，一個(gè) RNA polIII終止位點(diǎn)，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無(wú)需事前克隆到載體中。 ?和 siRNA表達(dá)載體不同的是， SECs不需要載體克隆、測(cè)序等頗為費(fèi)時(shí)的步驟，可以直接由 PCR得到，不用一天的時(shí)間。 ?SECs成為篩選 siRNA的最有效工具 ，甚至可以用來(lái)篩選在特定的研究體系中啟動(dòng)子和 siRNA的最適搭配。 ?如果在 PCR兩端添加酶切位點(diǎn) ，那么通過(guò) SECs篩選出的最有效的 siRNA后，可以 直接克隆到載體中構(gòu)建 siRNA表達(dá)載體 。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達(dá) siRNA和長(zhǎng)效抑制的研究。 ?主要缺點(diǎn)： ?① PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中（晶賽公司的 Protocol可以解決這一問(wèn)題） ?②不能進(jìn)行序列測(cè)定， PCR和 DNA合成時(shí)可能差生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致結(jié)果不理想。 ?最適用于：篩選 siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動(dòng)子 ? ?不適用于：長(zhǎng)期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了） 比較項(xiàng)目 化學(xué)合成 體外轉(zhuǎn)錄 RNase III降解dsRNA siRNA 表達(dá)載體 PCR 表達(dá)框 材料需求 21mer RNA
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