rnai的發(fā)現(xiàn)(編輯修改稿)
2024-11-29 17:14 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 內(nèi)源基因卻缺乏轉(zhuǎn)移性沉默，表現(xiàn)出沉默區(qū)域的保守性。這兩種現(xiàn)象在線蟲中也有發(fā)現(xiàn) ,但在哺乳動物和昆蟲中卻沒有發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。 ? 植物中的 RNAi跟兩種不同大小的 siRNA有關(guān)： 21nt和24ntsiRNA， 21nt由 RISC指導(dǎo)切割目的 mRNA，而 24nt則引發(fā)了系統(tǒng)性沉默和甲基化；而在動物中僅發(fā)現(xiàn) 21nt的siRNA。 RNAi研究的一般技術(shù)路線 制備 siRNA 的方法 （ 1）化學(xué)合成 ? 盡管化學(xué)合成是最貴的方法 ， 但是卻是最方便的 —— 研究人員幾乎不需要做什么工作 。 許多公司都可以根據(jù)用戶要求提供高質(zhì)量的化學(xué)合成 siRNA。 ? 主要的缺點包括價格高 ， 定制周期長 ， 特別是有特殊需求的 。 ? 由于價格比其他方法高 ， 為一個基因合成 3— 4對 siRNAs 的成本就更高了 ， 比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學(xué)合成 。 ? 最適用于： 已經(jīng)找到最有效的 siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究； ? 不適用于： 篩選 siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素 （ 2）體外轉(zhuǎn)錄 ? 相對化學(xué)合成法而言成本比較低 ， 是一種性價比高的篩選 siRNAs的好方法 。 ? 更重要的是能夠更快的得到 siRNAs。 ? 值得一提的是體外轉(zhuǎn)錄得到的 siRNAs只要較低的濃度就可以達到化學(xué)合成 siRNAs較高濃度得到的效果 。 ? 不足之處：實驗的規(guī)模受到限制 ， 雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的 siRNAs， 但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制 。 ? 最適用于： 篩選 siRNAs， 特別是需要制備多種siRNAs， 化學(xué)合成的價格成為障礙時 。 ? 不適用于： 實驗需要大量的 ， 一個特定的 siRNA。長期研究 。 Figure. Use of Chemically Synthesized and in Vitro Transcribed siRNAs targeting 223。Actin to Induce Gene Silencing. （ 3） 用 RNase III 消化長片斷雙鏈 RNA制備 siRNA ? 選擇通常是 200— 1000堿基的靶 mRNA模版，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA ? RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一種siRNAs ? 除掉沒有被消化的 dsRNA ? siRNA混合物直接轉(zhuǎn)染細胞 ? 最適用于： 快速而經(jīng)濟地研究某個基因功能缺失的表型 ? 不適用于： 長時間的研究項目 ， 或者是需要一個特定的siRNA進行研究 ， 特別是基因治療 Ku70 levels were reduced 86% in cells transfected with the siRNA cocktail, pared to nontransfected controls. （ 4） siRNA表達載體 ? 多數(shù)的 siRNA表達載體依賴 3種 RNA聚合酶 III 啟動子(pol III)中的一種 ， 操縱一段小的發(fā)夾 siRNA在哺乳動物細胞中的表達 。 包括的人源和鼠源的 U6啟動子和人H1啟動子 。 ? 之所以采用 RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子 RNA， 而且它是通過添加一串 （ 3到 6個 ） U來終止轉(zhuǎn)錄的 。 ? 使用這類載體，需要 2段編碼短發(fā)夾 RNA序列的 DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的 pol III 啟動子下游。 ? 最適用于： 已知一個有效的 siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默，或者需要用抗生素篩選能表達siRNA的細胞。長期研究。 ? 不適用于： 篩選 siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作） （ 5） siRNA表達框架 ? siRNA表達框架 (siRNA expression cassettes， SECs)是一種由 PCR得到的 siRNA表達模版 ， 能夠直接導(dǎo)入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中 。 ? 這個方法最早是由 Castanotto采用 ， 包括一個 RNA pol III啟動子 ， 一段發(fā)夾結(jié)構(gòu) siRNA， 一個 RNA pol III終止位點 。
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