已知基因序列的獲取策略(編輯修改稿)
2025-05-26 06:28 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 Vent、Pwo、 KOD、 Pyrobest、 PrimerStar等 ? PCR過程中 HotStart與 Touchdown的使用 ? 高保真 DNA 多聚酶與普通 rTaq的混合使用 ? PCR產(chǎn)物加 A尾進(jìn)行 TA克?。?循環(huán)即將結(jié)束時加入 rTaq 5U 72 ℃ 保溫 20～ 30 min ? 兩步變溫法 PCR 載體構(gòu)建中的常見問題 ? 利用單酶切位點將片段插入載體 ? 雙酶切中的問題 ? 對過長 cDNA片段 :可分段擴(kuò)增，再利用 RE位點或重疊延伸融合成全長 cDNA ? 酶切位點甲基化的問題 Cla I G6mATCGAT Xba I TCTAG6mATC 真核表達(dá)載體的選擇 ? Promoter Conventional/TissueSpecific/Inducible ? Poly (A) tail ? Kozak序列：－ 9GCCGCCA/GCCAUGG＋ 4 一個載體內(nèi)的多基因表達(dá) ? IRES系統(tǒng) ? 加 linker直接融合表達(dá) ? 多個獨立的表達(dá) cassettes：優(yōu)于共轉(zhuǎn)染表達(dá) SOE技術(shù)與基因人工合成及多基因融合 ? 基因設(shè)計與人工合成中的密碼子優(yōu)化 ? DNAWorks (Hoover, D. and Lubkowski, J., 2022) SOE： Spliced by overlapping extension 搭橋技術(shù)融合基因 三、引物設(shè)計 引物設(shè)計的 3條基本原則： ? 引物與模板的序列要緊密互補(bǔ) ? 引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)， ? 引物不能在模板的非目的位點引發(fā) DNA聚合反應(yīng) (即錯配
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