多所發(fā)生地方ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-25 23:23 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 cosmid vectors） 柯斯質(zhì)粒載體的應(yīng)用 ?噬菌體的位點特異切割體系 ——末端酶（ terminase）體系，識別兩個相距 3854kb cos位點，并進行切割，后被包裝。 下面的操作中缺點是： cosmid自我重組、外源 DNA片段串聯(lián) 后重組。 Ori Marker MCS cos ?DNA 質(zhì)粒 λ噬菌體 柯斯質(zhì)粒 單鏈噬菌體 克隆 DNA大片段 177。 * + + 構(gòu)建基因組文庫 + + 構(gòu)建 DNA文庫 + 常規(guī)的亞克隆化 + 構(gòu)建新型的 DNA結(jié)構(gòu) + 序列分析 + + 單鏈探針 +** + 外源基因在大腸桿菌中的表達 + 四種常用載體的比較 * 外源 DNA如超過 10kb，則重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和 DNA得率都非常低 ** 已有個別材料可用于此目的 第二節(jié) 基因操作的工具酶 一、 限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用 二、 DNA連接酶及其應(yīng)用 三、 DNA聚合酶及其應(yīng)用 四、 修飾性工具酶 （ 一）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) （ 二）限制性核酸內(nèi)切酶的分類 （ 三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名 （ 四） II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特性 （ 五）限制性核酸內(nèi)切酶的消化反應(yīng) 一、 限制性核酸內(nèi)切酶及其應(yīng)用 由寄主控制的 限制 和 修飾 現(xiàn)象 20世紀 60年代， Linn和 Arber 發(fā)現(xiàn) 大腸桿菌 B 大腸桿菌 K 1 1 4 10 — 4 10 — 4 成斑率 efficiency of plating 外源 DNA 自身 DNA （一）核酸限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) ： 切酶 。 EcoB核酸酶和 EcoB甲基化酶 當(dāng) λ(k) 噬菌體侵染 ，由于其 DNA中有 EcoB核酸酶特異識別的堿基序列，被降解掉。而 DNA中雖然也存在這種特異序列，但可在 EcoB甲基化酶的作用下，催化 S腺苷甲硫氨酸（ SAM）將甲基轉(zhuǎn)移給限制酶識別序列的特定堿基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能識別已甲基化的序列。 限制 —修飾的酶學(xué)系統(tǒng) 酶切位點 不被修飾 噬菌體 DNA 被切割 酶切位點 被修飾 基因組 DNA 不被切割 ?最早分離出的限制內(nèi)切酶 —1968年，Meselson和 Yuan， 大腸桿菌 B和 K菌株， EcoB和 EcoK， 是 I型的，沒有實用價值。 ?首個 II型限制內(nèi)切酶 —1970年， Heamophilus influenzae的 Rd菌株中 Hind II 。 使得 DNA分子的體外精確切割成為可能。 ?從此，相關(guān)研究展開。如 NEB公司的提取和克隆。目前 已純化出 3000種限制性內(nèi)切酶中 ， 其中有 30%是在 NEB發(fā)現(xiàn)的 。 ?限制性核酸內(nèi)切酶（ restriction endonuclease ）：是一類能夠識別雙鏈 DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割 DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。切開的是 3， 5－磷酸二酯鍵。 （二）限制性核酸內(nèi)切酶的類型及其主要特性 特性 1. 限制修飾活性 2. 內(nèi)切酶的蛋白 質(zhì)結(jié)構(gòu) 3. 限制輔助因子 4. 切割位點 5. 特異性切割 6. 基因克隆中 I 型 雙功能的酶 3種不同亞基 ATP、 Mg2+和 S腺苷甲硫氨酸 距特異性位點5?端至少 1000bp 不是（隨機） 無用 II 型 限制酶和修飾酶分開 單一成分 Mg2+ 位于識別位點上 是 非常有用 III 型 雙功能酶 2種亞基 ATP、 Mg2+和 S腺苷甲硫氨酸 特異性位點 3?端2426bp處 是 用處不大 （三）限制性核酸內(nèi)切酶的命名 寄主菌屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成 3個斜體 字母的略語表示酶來源的菌種名稱，如大腸桿菌 Escherichia coli 表示為 Eco , 流感嗜血菌 Haemophilus influenzae 表示為 Hin； 用一個正體字母表示菌株的類型，比如 EcoR、 Hind； 如果一種特殊的寄主菌株具有幾個不同的限制修飾體系，則 用羅馬數(shù)字標出，比如 Eco R I、 Hind III。 （四） II型限制性核酸內(nèi)切酶的基本特點 識別位點的特異性 每種酶都有其特定的 DNA識別 位點，通常是由 4～ 8個核苷酸組成的特定序列（靶序列）。 識別序列的對稱性 靶序列通常具有雙重旋轉(zhuǎn)對稱 的結(jié)構(gòu)，即雙鏈的核苷酸順序呈回文結(jié)構(gòu)。 切割位點的規(guī)范性 交錯切或?qū)ΨQ切（可形成粘性末端或平末端的 DNA分子）。 幾種 II型限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點 Pst I Provindencia stuartii 164 CTGCAG GACGTC Haemophilus influenzae Rd 與 II型核酸內(nèi)切酶有關(guān)的幾個概念 粘性末端 cohesive ends是指 DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu)，它們能夠通過互補堿基間的配對而重新環(huán)化起來。 平 末 端 Blunt end在識別序列對稱處同時切開 DNA分子兩條鏈，產(chǎn)生的平齊末端結(jié)構(gòu)。則不易于重新環(huán)化。 同裂酶 isoschizomers 能識別和切割同樣的核苷酸靶序列的不同來源的內(nèi)切酶。不同同裂酶對位點的甲基化敏感性有差別。 同尾酶 isocaudamers 識別的靶序列不同，但能產(chǎn)生相同粘性末端的一類限制性核酸內(nèi)切酶。如 BamH I 、 BclI、 BglII和 Xho I 是一組同尾酶。 注 意： 由同尾酶產(chǎn)生的粘性末端序列很容易重新連接，但是兩種同尾酶消化產(chǎn)生的粘性末端重新連接形成的新片段將不能被該兩種酶的任一種所識別。 平齊末端 帶 5?－ P端的黏性末端 帶 3?－ OH 和 5?－ P端的平末端 例如 HpaⅡ 和 MspⅠ 是同裂酶，識別順序都是 5?…… C|CG G…… 3? 3?…… G GC|C…… 5? 如果其中有 5’甲基胞嘧啶， HpaⅡ 不能夠切割， MspI能切割。 經(jīng)同尾酶消化的 DNA末端連接示意圖
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