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2025-04-28 23:23本頁面
【正文】 ATCGGA CCG GGCTATCGGA Pol I + Mg2+＋ 4dNTPs A T A G CCT CCGATAGCCT GGCTATCGGA CCGATAGCCT GGCTA CCGATAGCCT GGCTATCGGA Pol I + Mg2+ ＋ 4dNTPs CCGATAGCCT GGCTA Pol I + Mg2+ 大腸桿菌 DNA聚合酶 I 的三種用途 A. 利用缺口轉(zhuǎn)移法制備高比活度的 DNA探針 利用其 5′3′的外切酶活性及其聚合酶活性。 B. 用于 DNA連接前的大缺口填充 利用 5′3′的聚合酶活性。 C. 用于 DNA的序列分析 利用 5′3′的聚合酶活性。 大腸桿菌聚合酶 I的應(yīng)用示例 缺口轉(zhuǎn)移制備探針 Pol I + Mg2++［ α － 32P］ dNTPs （二） Klenow片段酶 Klenow片段 是大腸桿菌聚合酶 I 全酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生的大片段酶分子，分子量為 76KD 。 酶催活性： ⑴ 5? →3 ? 的聚合酶活性 ⑵ 3? →5 ? 的核酸外切酶活性 CCGATAGCCT GGCTA CCGATAGCCT GGCTA Klenow+Mg2+ Klenow片段的主要用途（ 利用 5? →3 ? 的聚合酶活性） ⑴修補限制性酶消化 DNA形成的 3′ 隱蔽末端 ⑵標記 DNA片段的末端 底物用［ α － 32P］－ dNTPs ⑶ cDNA克隆中第二鏈 cDNA的合成 ⑷ DNA序列的測定 （三） T4DNA聚合酶 T4DNA聚合酶是 從 T4噬菌體感染了的大腸桿菌中分離出來的， 酶催活性： ⑴ 5′→3′ 的聚合酶活性 ⑵ 3 ′→ 5 ′ 的核酸外切酶活性。 其外切酶活性要比大腸桿菌聚合酶 I 的活性高 200倍。 比 Klenow 片段酶 強 100～ 1,000倍。 因此，可以綜合利用這兩種活性進行 取代合成 反應(yīng)： 如果反應(yīng)體系中僅存在一種 dNTP或沒有底物時，這時 T4DNA聚合酶就會表現(xiàn)出 3 ′→ 5 ′ 外切酶活力，從雙鏈 DNA的 3′ 開始降解，直到露出底物 dNTP相同的堿基。然后就在此位置發(fā)生合成和取代反應(yīng)。 CGTCGC GCAGCG CGTCGC GCAGCG dTTP Mg++ CGT GCAGCG α － 32P － dNTPs Mg++ T4DNA聚合酶的用途 利用取代合成反應(yīng)制備探針 標記具有平末端的或具有 3?－隱蔽末端的DNA片段 利用較強的 3 ′→ 5 ′ 外切酶活性和 5′→3′ 聚合活性 用于 DNA序列分析 （四） 逆轉(zhuǎn)錄酶 —Reverse transcriptase 逆轉(zhuǎn)錄酶 是一種依賴 RNA的 DNA聚合酶。 此酶首先是 1970年從鼠白血病毒和勞氏肉瘤病毒中發(fā)現(xiàn)的。 這兩個課題組的論文都發(fā)在了同一期的 《 Nature》 雜志上。 最普遍使用的是從鳥類骨髓母細胞瘤病毒（ AMV）分離出來的。 活性： 一種可以有效地將 mRNA反轉(zhuǎn)錄成 DNA的酶，其產(chǎn)物稱為cDNA(plementary DNA). 主要用途是 將 mRNA轉(zhuǎn)錄成 cDNA以制備基因片段。 3? AAAAAAAA AAAAAAAA 5? TTTTTTTTT AAAAAAAA TTTTTTTTT 5? TTTTTTTTT 3? AAAAAAAA 堿水解 反轉(zhuǎn)錄酶＋ oligo(dT) 帶 poly(A)的 mRNA cDNA SI核酸酶 Klenow酶 （ 一）末端轉(zhuǎn)移酶（ terminal transferase） （ 二） SI核酸酶（ SI nuclease） （ 三）堿性磷酸酶 四、修飾性工具酶 （一）末端轉(zhuǎn)移酶 ?末端轉(zhuǎn)移酶是一類不依賴于 DNA模板的 DNA聚合酶 。 ?特性： 該類酶可以在沒有模板鏈存在的情況下 ，將核苷酸連接到 dsDNA或 ssDNA的在 3?－ OH。特別是對于平末端的雙鏈 DNA末端加尾十分有用 。 ?最常見的用途： 給外源 DNA片段及載體分子加上互補的同聚物尾巴 ， 以創(chuàng)造黏性末端 ， 便于重組 。 平末端 DNA片段的末端加尾連接法 3? 3? 5? 5? 3? 3? 5? 5? 末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶 +dATP +dTTP 3? 3? 5? 5? 3? 3? 5? 5? AAAAA TTTT DNA聚合酶和 T4DNA連接酶 （二） SI核酸酶 這是一種從米曲霉（ Aspergillus oryzae）中分離的 高度單鏈特異的外切酶。 活性： 可以降解單鏈 DNA或 RNA或雙鏈的單鏈區(qū) 。 ssDNA或 RNA 5? 3? SI酶、 Zn2+、 5?dNMPs或 5?rNMPs SI酶、 Zn2+、 + 帶缺口的 DNA或 RNA SI酶、 Zn2+、 黏性末端 平末端 其主要用途有： ⑴ 在 cDNA合成過程中，切開 cDNA的發(fā)夾末端； ⑵ 載體構(gòu)建過程中，切去 DNA片段的單鏈尾巴， 形成平末端結(jié)構(gòu)。 3? AAAAAAAA AAAAAAAA 5? TTTTTTTTT AAAAAAAA TTTTTTTTT 5? TTTTTTTTT 3? AAAAAAAA 發(fā)夾結(jié)構(gòu)的切除 單鏈尾巴的切除 （三） 堿性磷酸酶 從大腸桿菌中分離的細菌堿性磷酸酶（ Bacterial Alkaline Phosphatase）簡稱 BAP 。 從小牛腸中分離的叫小牛腸堿性磷酸酶（ Calf Intestinal Alkaline Phosphatase） ，簡稱 CIP，用的廣泛。 酶催功能： 脫磷酸作用，將單鏈或雙鏈 DNA或 RNA5?－ P轉(zhuǎn)化成 5?－ OH。 其主要用途有： ⑴在用 32P標記 DNA 5′端之前，去除 5′端的磷； ⑵在 DNA重組技術(shù)中，去除 DNA片段的 5′磷酸，防止載體的自身環(huán)化，提高重組子比例。 載體去磷防止自連的應(yīng)用示例 P OH P OH OH OH OH OH P OH P OH OH OH OH OH 連接酶 連接酶 連接酶 堿性磷酸酶 CIP 寄主修復(fù)缺口 載體自連或產(chǎn)生二具體等 基因工程的基本步驟 基因分離酶切 載體酶切 基因和載體連接 導(dǎo)入細菌 重組質(zhì)粒繁殖 重組克隆的選擇 序列分析和基因表達等研究 導(dǎo)入植物細胞
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