【文章內(nèi)容簡介】 提高了牛克隆胚胎的發(fā)育能力[]（圖）。這些核移植重編程理論上的突破使得近幾年體細胞核移植效率不斷地提升，也不斷地推進著體細胞核移植技術(shù)的運用[]。圖. 使用能夠提高克隆牛的出生率[]。 關(guān)鍵實驗內(nèi)容和技術(shù)指標說明 (一) 卵母細胞的采集與質(zhì)量控制在克隆技術(shù)的研究中，原核期受精卵、期卵母細胞、期卵母細胞以及細胞期卵裂球細胞都已經(jīng)被證明可以作為受體胞質(zhì)進行體細胞克隆。同時有研究表明用體內(nèi)成熟的卵母細胞進行體細胞克隆其重構(gòu)胚胎的囊胚率和出生率均高于用體外成熟培養(yǎng)的卵母細胞，但鑒于采集體內(nèi)成熟的卵母細胞操作復雜且經(jīng)濟成本較高，難以大規(guī)模生產(chǎn)，因此本標準推薦使用體外培養(yǎng)成熟的卵母細胞進行體細胞克隆。體外培養(yǎng)成熟的卵母細胞的質(zhì)量是決定克隆胚胎發(fā)育的關(guān)鍵因素。影響體外培養(yǎng)成熟的卵母細胞質(zhì)量的因素有多種。本標準從卵巢和卵母細胞的選擇上控制卵母細胞質(zhì)量，從而確保下游體細胞克隆胚胎的正常發(fā)育，具體而言，本標準推薦從（）卵泡直徑，（）卵巢的運輸條件，（）卵丘細胞包裹層數(shù)三個技術(shù)指標控制卵母細胞質(zhì)量。圖 哺乳動物中卵泡發(fā)育與卵母細胞成熟（1） 卵泡直徑卵母細胞體外成熟質(zhì)量與卵泡大小緊密相關(guān)。在體內(nèi)，哺乳動物卵母細胞后續(xù)發(fā)育能力是在卵泡生長過程中逐漸獲得的（圖），卵母細胞的發(fā)育始于卵泡進入生長階段，持續(xù)時間在各物種間有所差別。哺乳動物體內(nèi)生長的卵母細胞其蛋白翻譯和 轉(zhuǎn)錄活動一直持續(xù)到格生發(fā)泡破裂前。因此卵巢上分布的不同大小的卵泡中的卵母細胞所處的發(fā)育階段不同。研究表明直徑過小的卵泡發(fā)育不完全，其中的卵母細胞不具有體外成熟的能力，而直徑過大的卵泡中的卵母細胞體外培養(yǎng)后可能老化。所以通常選擇直徑在 的卵泡中的卵母細胞。孟慶剛等()比較了 以下豬卵泡獲得的卵母細胞與 卵泡獲得的卵母細胞體外培養(yǎng)后的成熟率（表），發(fā)現(xiàn) 以下卵泡母細胞的成熟率()顯著低于 卵泡卵母細胞的成熟率()。同樣，山羊的大腔卵泡( )卵母細胞的體外成熟率顯著高于小腔卵泡( )卵母細胞的體外成熟率[]。牛的 卵泡卵母細胞也比小卵泡的成熟率高，且直徑大于 的卵泡其成熟率與發(fā)育率各項指標均顯著低于 和 ～ 組 () []。除以上研究外，還有國內(nèi)外其他學者在豬[]、牛[]、羊、駱駝等物種中的研究也得到類似結(jié)果。表 不同直徑的豬卵泡卵母細胞成熟情況[]卵母細胞類型數(shù)目發(fā)育階段（） 以下卵泡卵母細胞（）（）（）（）（）卵泡卵母細胞（）（）（）（）（）注：代表差異顯著（）。、為卵母細胞發(fā)育的不同階段。指退化或死亡的卵母細胞。本標準綜合以上研究結(jié)果，推薦選用直徑 的豬以及羊的卵泡抽取卵母細胞進行體外培養(yǎng)，選取直徑 的牛的卵泡抽取卵母細胞。（）卵巢的運輸條件一般而言，從屠宰場采集的卵巢越快進行后續(xù)操作越好，但由于屠宰場一般距離實驗室較遠，需要一定運輸時間。這時，卵巢的運輸條件就需要特別注意了，有研究發(fā)現(xiàn)[]，母豬卵巢離體 內(nèi)運回實驗室都不會有顯著影響，但運輸時的保存溫度過高或過低都會對卵母細胞質(zhì)量產(chǎn)生很大的影響。目前報道的采集豬卵巢所用生理鹽水溫度高低不盡相同，從℃到℃均有報道，另外，張坤等[]發(fā)現(xiàn)季節(jié)的變化顯著影響豬卵母細胞來源的孤雌和體細胞克隆胚胎的體外或體內(nèi)發(fā)育能力。說明季節(jié)變化引起的諸如環(huán)境溫度的冷熱應(yīng)激可能會通過影響母豬而影響卵巢和卵母細胞的功能，因此不同季節(jié)采集的卵母細胞其質(zhì)量也會有所不同。工作組根據(jù)實際的體細胞克隆工作經(jīng)驗，推薦采集卵巢時，放入℃℃的生理鹽水中保溫運輸。（）卵丘細胞包裹層數(shù)除卵泡直徑外，卵母細胞卵外包裹的卵丘細胞的層數(shù)也對卵母細胞體外成熟有著重要的影響。在體內(nèi)狀態(tài)下，卵母細胞后續(xù)發(fā)育能力是在卵泡生長過程中逐漸獲得的，而卵丘細胞是卵泡中最重要的體細胞，其通過縫隙連接與卵母細胞之間保持密切的聯(lián)系，為卵母細胞的發(fā)育提供營養(yǎng)、能量和調(diào)節(jié)信號等，保證卵母細胞的成熟。卵母細胞在體外可以通過卵丘顆粒胞提供營養(yǎng)和調(diào)節(jié)信號。主要作用是：增加卵母細胞表面積,使更多營養(yǎng)物質(zhì)進入卵母細胞；借助旁分泌作用，調(diào)節(jié)卵母細胞的發(fā)育；卵丘細胞和卵母細胞的縫隙連接，有利于運輸卵母細胞發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。等()發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)小鼠裸卵可以逐步發(fā)生生發(fā)泡破裂（ , ），但不足以最終完成減數(shù)分裂。而有卵丘細胞包繞的卵母細胞在、和促性腺激素的作用下，培養(yǎng) ，發(fā)生的百分率為，且發(fā)生的卵母細胞有以上達到期。表 卵丘細胞對卵母細胞成熟的影響[]項目培養(yǎng)卵母細胞數(shù)卵母細胞數(shù)（成熟率）優(yōu)級卵（177。）次級卵（177。）注：同一列相同字母表示差異不顯著( )，不同字母表示差異顯著（）下同。表 卵丘細胞對孤雌胚胎發(fā)育潛能的影響[]項目卵母細胞數(shù)（個）卵裂數(shù)（卵裂率）囊胚數(shù)（囊胚率）總細胞數(shù)優(yōu)級卵（177。）（177。）177。次級卵（177。）（177。）177。石俊松等研究發(fā)現(xiàn)[]，胞質(zhì)均勻且包被層以上豬卵母細胞（優(yōu)級卵）的成熟率高于層以下層以上的卵母細胞（次級卵）（177。 177。）（表），且差異極顯著(＜)；將成熟的卵母細胞進行孤雌激活后，優(yōu)級卵的囊胚率高于次級卵 （177。 177。），且差異極顯著(＜)，但囊胚總細胞數(shù)兩者無顯著差異(＞) （表）；將成熟的卵母細胞進行體外受精后，優(yōu)級卵的囊胚率、囊胚總細胞數(shù)均高于次級卵 （177。 177。，177。 177。），且差異極顯著(＜)；進行受精卵孵育時，未去除卵丘細胞的胚胎卵裂率、囊胚率、囊胚總細胞數(shù)均高于去除卵丘細胞的（177。 177。，177。 177。，177。 177。），且差異極顯著(＜)。以上結(jié)果說明：卵丘細胞層數(shù)較多的卵母細胞成熟率高，且其孤雌和體外受精胚胎的發(fā)育潛能也好；卵丘細胞存在時，有助于卵母細胞的受精及以后的胚胎發(fā)育。因此在挑取卵母細胞與卵丘細胞復合體（ , ）時，本標準推薦挑取有層以上卵丘細胞緊密包圍，細胞胞質(zhì)均勻、透亮的進行成熟培養(yǎng)。（）其他條件其他會影響卵母細胞質(zhì)量的因素還包括培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)液等。