基因工程課后習(xí)題答案(編輯修改稿)
2024-12-02 09:59 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 部分酶解整個(gè)基因組 DNA，得到大量的 DNA 片段，將這些片段與 載體連接，再轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中去，讓宿主菌長(zhǎng)成克隆。這樣 ，一個(gè)克隆內(nèi)的每個(gè)細(xì)胞的載體上都包含有特定的基因組 DNA 片段，整個(gè)克隆群體就包含基因組的全部基因片段總和稱為基因組文庫(kù)。 cDNA 構(gòu)建技術(shù)： 載體：普通質(zhì)粒（表達(dá)型），受體細(xì)胞：大腸桿菌（繁殖迅速，易于保存，克隆操作簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化效率高） 提取細(xì)胞內(nèi)總 RNA，用 Oligo(dT)探針?lè)蛛x其中的 mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成 cDNA，將單鏈 cDNA 變成雙鏈，用合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，與載體相連，轉(zhuǎn)化宿主菌，挑選陽(yáng)性克隆，形成文庫(kù) 第三章 簡(jiǎn)述外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的基本原理。 強(qiáng)化蛋白質(zhì)生物合成，抑制蛋白產(chǎn) 物降解，維持或恢復(fù)蛋白質(zhì)特異性空間構(gòu)象 啟動(dòng)子：選用強(qiáng)啟動(dòng)子， 10 區(qū)和 35 區(qū)兩個(gè)六聚體盒的堿基組成以及彼此的間隔長(zhǎng)度（ 17bp），可控性啟動(dòng)子（ Lac 啟動(dòng)子） 終止子：強(qiáng)終止子， rrnT1T2， 否則會(huì)形成長(zhǎng)短不一的 mRNA 混合物 SD 序列： 5’ UAAGGAGG339。,考慮 SD 序列與翻譯起始密碼子之間的堿基組成 密碼子：更換外源基因中不適宜的相應(yīng)密碼子；將與外源基因密碼子相關(guān)的 tRNA 編碼基因同步克隆。 將外源基因至于這個(gè)可控的基因框架內(nèi) 簡(jiǎn)述外源基因在大腸桿菌中幾種主要的表達(dá)方式及其優(yōu)缺點(diǎn)。 包含體型 異源蛋白的表達(dá)： 優(yōu)點(diǎn)： 離心 , 蛋白酶不 再 構(gòu)成威脅 缺點(diǎn)：包含體中的蛋白質(zhì)中的氨基酸序列不具備正確的折疊結(jié)構(gòu)，無(wú)活性 分泌型異源蛋白的表達(dá)： a) 通過(guò)蛋白質(zhì) N 端信號(hào)肽將蛋白質(zhì)通過(guò)運(yùn)輸或分泌的方式定位在細(xì)胞周質(zhì)（內(nèi)膜與外膜之間的空隙）或直接分泌到培養(yǎng)基中的，稱為分泌蛋白 b) 一些蛋白分泌到胞外，會(huì)增加其穩(wěn)定性 c) 將大腸桿菌分泌型蛋白的信號(hào)肽與外源基因相連，轉(zhuǎn)化分泌型受體細(xì)胞，則可獲得分泌在培養(yǎng)基中的重組異源蛋白。 缺點(diǎn)：表達(dá)率要比包含體 方式低很多， 且大腸桿菌對(duì)真核生物的蛋白質(zhì)分泌機(jī)制不健全，難以表達(dá) 。 融合型異源蛋白表達(dá) ： a) 外源基因 +受體菌自身蛋白基因 → 融合基因 → 表達(dá)融合蛋白（內(nèi)源基因 N 端，外源基因 C 端） b) 優(yōu)點(diǎn)： 1）增加了穩(wěn)定性 2）便于體外純化 3）表達(dá)效率高 缺點(diǎn)： 目的蛋白需要回收（需要裂解和進(jìn)一步分離才能獲得目的蛋白，還需要回收 ， 成本 較高 ） 簡(jiǎn)述大腸桿菌工程菌遺傳不穩(wěn)定性的主要表現(xiàn)形式及解決途徑 a) 不穩(wěn)定主要兩種形式 i.
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