【文章內容簡介】 l肉水中加入蛋白胨10g、氯化鈉5g，加熱溶解，放涼。 3．用精密pH試紙測酸堿度，用10％。過堿時，可用10％醋酸校正之。 4．分裝于試管中或三角燒瓶中，15磅(121℃)高壓蒸氣滅菌20～30min。 如用市售的牛肉膏代替新鮮肉水時，～％的水溶液，再如上法制成培養(yǎng)基。(二)普通瓊脂培養(yǎng)基 普通瓊脂培養(yǎng)基是常用的固體培養(yǎng)基，包括普通瓊脂平板和普通瓊脂斜面兩種，前者用于分離純種細菌，后者用于增殖純種細菌或保存菌種。 【材料】 ① 肉水 200ml ② 蛋白胨 2g ③ 氯化鈉 1g ④ 瓊脂 5g ⑤ 無菌平皿、滅菌試管、三角燒瓶等。 【方法】 1．按上記數量把肉水、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂放到三角燒瓶中，加熱溶化。 2．趁熱用pH試紙測酸堿度，用10％。 3．15磅高壓蒸氣滅菌20～30min。 4．趁熱將溶化的培養(yǎng)基倒入滅菌平皿內，每個平皿倒入約15ml，凝固后即成普通瓊脂平板培養(yǎng)基；如趁熱將培養(yǎng)基倒入滅菌試管內，再將試管斜放試驗臺上，凝固后即成普通瓊脂斜面培養(yǎng)基。 瓊脂系由海藻中提取的一種多糖，俗稱洋粉，具有100℃溶化，40℃凝固的特性。細菌不能分解瓊脂，故無營養(yǎng)作用，僅是固體培養(yǎng)基的賦形劑。 普通瓊脂培養(yǎng)基也可用市售的營養(yǎng)瓊脂粉(含有普通瓊脂培養(yǎng)基的各種成分并已調好pH)制備，用法見產品說明書。(三)血液瓊脂培養(yǎng)基 有些細菌其營養(yǎng)要求較高，在普通瓊脂培養(yǎng)基上生長不良，可用血液瓊脂培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。 【材料】 ① 普通瓊脂培養(yǎng)基 200ml ② 血液(脫纖維羊血或兔血) 10～20ml 【方法】 1．加熱溶化普通瓊脂培養(yǎng)基。 2．待冷至50℃左右時，加入無菌的脫纖維血液，混勻(注意勿使產生泡沫)。 3．分注于滅菌試管或平皿中制成血斜面和血平板培養(yǎng)基。實驗2 細菌分離培養(yǎng)與純培養(yǎng)細菌分離培養(yǎng)法是指將臨床材料接種于適當的培養(yǎng)基(Media)上進行孵育，分離獲得純種細菌的方法。只有獲得純種細菌才能鑒定細菌，研究細菌的生物學特性、致病性及對藥物的敏感性，進而指導臨床治療疾病。本次實驗的目的是學習細菌分離培養(yǎng)與純培養(yǎng)法，掌握幾種常用的細菌接種技術。 【材料】 ① 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌24h混合肉湯培養(yǎng)物 ② 普通瓊脂平板培養(yǎng)基 ③ 普通瓊脂斜面培養(yǎng)基 ④ 肉湯培養(yǎng)基 ⑤ 革蘭氏染色液 ⑥ 生理鹽水 ⑦ 載物玻片，接種環(huán)等。 【方法】1．平板培養(yǎng)基接種的分離培養(yǎng)法 平板培養(yǎng)基具有較大的表面積，用于從混雜的檢查材料中分離出純種細菌，其要點是如何獲得較多的孤立菌落。最常用的平板接種法是劃線法，根據檢查材料中含菌量的多少，可采用不同的劃線方法：①連續(xù)劃線法：檢查材料中含菌量較少時，可用本法。先將接種環(huán)用火焰滅菌，待冷卻后挑取檢查材料，涂于平板的上端，隨即向下連續(xù)平行劃線至平板的中部，然后將平板旋轉180176。，由平板的另一端連續(xù)平行劃線至平板的中部(圖2—1a)。劃線時接種環(huán)與平板表面所成的角度要小，以免劃破瓊脂。劃線要密而不重復，充分利用平板的表面。 ②分段劃線法：檢查材料中含菌量較多時，可用此法以求獲得孤立菌落。先將檢查材料涂于平板上端后，然后將接種環(huán)用火焰滅菌，冷卻后使接種環(huán)通過已涂于平板上端的接種材料劃線于“1”區(qū)(圖2—1b)。再將接種環(huán)火焰滅菌，待冷卻后再劃線于“2”區(qū)。同法再劃線于“3”區(qū)?？筛鶕康牟煌瑳Q定分段的數目。劃線完畢，先蓋好平板，再將接種環(huán)上殘留的細菌用火焰滅菌。在平皿底面，用特殊鉛筆寫上班級、學號和材料號，然后使平皿底面向上放于鐵絲筐中，送37℃溫箱培養(yǎng)，經18～24h，可觀察有無孤立菌落生長，每一孤立菌落即為一純種細菌。一般病原菌的菌落數少于雜菌，故在分離培養(yǎng)時，應力求出現較多的孤立菌落，以提高病原菌檢出率。 【結果觀察】 ①菌落形態(tài)：首先一般先觀察整個平板培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)及種類，然后再選有代表性的各種孤立菌落做如下的詳細觀察。 大?。阂话憧擅枋鰹獒樇獯?、粟粒大等，也可按實測mm數表示之。 大菌落(直徑在5mm以上) 中等大菌落(直徑在3mm左右) 小菌落(直徑在1mm左右) 形狀：點狀、圓形、卵圓形、葉狀等。 邊緣：整齊、鋸齒狀、毛發(fā)狀等。 表面：光滑、皺紋、濕潤、干燥等。 隆起度：凸起、扁平、中心凹陷等。 結構：均質性、顆粒狀等。 色調：無色、白色、黃色、褐色等。 透明度：透明、半透明、不透明等。 觀察菌落時，不要將空氣中落入培養(yǎng)基而生長的雜菌誤認為目的細菌。雜菌一般生長于劃線痕跡外，或為個別的形狀異常的孤立菌落。另外觀察時，也要注意保護好平板，勿使再落入雜菌。 ②細菌形態(tài)：選擇經肉眼詳細觀察過的不同種類的孤立菌落各一個，用特殊鉛筆在平皿底部作圈記并編號，然后再涂膜，做革蘭氏染色。 涂膜方法：先取載物玻片，用特種鉛筆在玻片背面畫兩個圓圈，并寫上與平皿上菌落相同的號碼。用接種環(huán)按無菌操作取材法沾取生理鹽水，于每一圓圈內各放一滴。再用接種針按無菌操作法分別從選好的菌落上挑取細菌，按編號在載物片上涂于生理鹽水內，做成薄而均勻的涂膜。挑菌時不要取菌太多，不要觸碰其它菌落，涂膜切勿太厚，否則影響鏡檢效果。染色后鏡檢，注意觀察視野內是否為形態(tài)相同的純種細菌，注意其形態(tài)、排列、染色性等，如有不同，則可能挑菌時觸碰其它菌落，應另選菌落涂片染色。以上所學習的是最經典的培養(yǎng)方法，目前臨床檢驗常使用全自動培養(yǎng)儀，大大提高了培養(yǎng)的效率和質量。全自動快速血培養(yǎng)儀（Bact Alert 120）能從血液和體液中快速檢出需氧菌、厭氧菌、L型細菌和真菌，一般24h內檢出率達85%，48h內檢出率達95%以上。2．斜面培養(yǎng)基接種的純培養(yǎng)法 斜面培養(yǎng)基不易污染，常用于培養(yǎng)純種細菌。斜面培養(yǎng)基通常也采用劃線接種法。接種時，右手持接種環(huán)，先將接種環(huán)滅菌，待冷后挑取平板上孤立菌落的細菌。將平板放回原處后，用左手取斜面培養(yǎng)基，用右手小指和手掌拔去試管棉塞，將試管口通過火焰略微加熱滅菌，再將接種環(huán)插入試管(勿觸碰管壁)，由斜面底部向上劃一直線，然后再從斜面底部向上連續(xù)平行劃線(圖2—2)。劃線完畢，再將試管口通過一下火焰，棉塞滅菌后，塞好棉塞，最后將接種環(huán)上的殘留細菌用火焰滅菌。接種好的斜面培養(yǎng)基放37℃溫箱培養(yǎng)18～24h，所接種的細菌則生長為均質的菌苔。此培養(yǎng)物來自孤立菌落，為純種，可用于該菌的各種生物學性狀檢查。3．液體培養(yǎng)基接種法可采用“雙管移植法”(圖2—3)，將瓊脂斜面上生長的細菌移植于肉湯培養(yǎng)基中，即左手持細菌培養(yǎng)物和肉湯培養(yǎng)基兩支試管，右手持接種環(huán)，按無菌操作法取少量細菌，在肉湯表面稍上的管壁上輕輕研磨，使細菌混入培養(yǎng)基內。接種后放37℃溫箱培養(yǎng)18~24h，肉眼觀察，如培養(yǎng)基出現混濁或形成菌膜、沉淀等，則表示有細菌增殖，觀察其增殖狀態(tài)，有助于鑒別細菌。4．高層培養(yǎng)基接種法 細菌實驗室為保存菌種或測定細菌有無動力，常制成固體或半固體的高層培養(yǎng)基，某些生化性狀檢查也使用高層培養(yǎng)基(如醋酸鉛培養(yǎng)基)。高層培養(yǎng)應采用穿刺接種法，用接種針取菌落或斜面培養(yǎng)基上的純種細菌，穿刺于培養(yǎng)基的中心，但不可直刺至試管底，一般刺入高層培養(yǎng)基三分之二高度即可(圖2—4)。實驗3 細菌生化反應檢查法 有些細菌雖屬于不同種或型，但其形態(tài)和菌落特點基本相同，只依靠形態(tài)和菌落的觀察，不能加以區(qū)別。然而，這些不同種型的細菌，其物質代謝能力和產物常有所不同，借此可以鑒別細菌，即為細菌的生化反應檢查，生化反應檢查必須使用純種細菌。本次實驗的目的是了解細菌生化反應常用培養(yǎng)基的制備方法和學習常用于腸道桿菌鑒別的幾種生化反應。（一）細菌生化反應常用培養(yǎng)基的制備 1．蛋白胨水 成分：、蒸餾水100ml ，分裝試管，15磅15min高壓滅菌備用。常用于制備糖發(fā)酵培養(yǎng)基或用于檢查細菌的靛基質產生試驗等。 2．糖發(fā)酵管 成分：蛋白胨水，葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖或麥芽糖等糖，溴甲酚紫(B．C．P)、溴麝香草酚蘭(B．T．B)或酚紅(P．R)等指示劑。 在蛋白胨水中加入某種糖(～1％)和指示劑，分裝于帶一倒立小管的小試管中(圖2—5)，15磅20min高壓滅菌后備用。常用于糖發(fā)酵試驗。 3．葡萄糖蛋白胨水 成分：蛋白胨 葡萄糖 磷酸氫二鉀 蒸餾水 100ml，分裝試管，10磅20min高壓滅菌備用。用于V—P試驗和甲基紅試驗。4．枸櫞酸鹽培養(yǎng)基成分：枸櫞酸鈉 硫酸鎂 磷酸二氫銨 磷酸氫二鉀 氯化鈉 瓊脂(經流水連續(xù)徹底漂洗) 蒸餾水 100ml(％) ，％B．T．B乙醇溶液混勻，分裝試管，8磅15min高壓滅菌，趁熱取出置成斜面。 用于枸櫞酸鹽利用試驗。 5．醋酸鉛培養(yǎng)基 成分：普通瓊脂培養(yǎng)基 100ml 硫代硫酸鈉 醋酸鉛溶液(10％) 1ml 先溶化普通瓊脂培養(yǎng)基，然后加入硫代硫酸鈉，煮沸過濾，10磅20min高壓滅菌，取出后無菌操作加入已滅菌的10％醋酸鉛溶液1ml，混勻后裝于小試管，直立凝固后備用。用于檢測硫化氫的產生。 6．尿素培養(yǎng)基 成分：蛋白胨 氯化鈉 磷酸二氫鉀 瓊脂 蒸餾水 100ml 酚紅溶液(％) 葡萄糖溶液(10％) 尿素(20％) 1ml 在蒸餾水內加熱溶化蛋白胨、氯化鈉、磷酸二氫鉀和瓊脂，％酚紅溶液混勻，8磅15min高壓滅菌，取出待冷至60℃，加入滅菌的10％葡萄糖溶液和20％尿素，分裝于小試管內，凝成斜面?zhèn)溆?。用于尿素分解試驗? (二)細菌生化反應檢查法 1．糖發(fā)酵(Fermentation of sugars) 將細菌接種于糖發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)18～24h后觀察結果。必要時可培養(yǎng)更長時間后再判定結果。 細菌如分解糖時，則產酸，使指示劑變色(一般記錄符號是“十”)；有些細菌在分解糖的同時還產生氣體，則倒立小管中有氣泡出現(記錄符號為“⊕”)；如細菌不分解該糖時，指示劑不變色，不見培養(yǎng)液混濁(記錄符號為“―”)。 2．IMViC 包括下述四種試驗：① 靛基質產生(Production of indole)將細菌接種于蛋白胨水中，37℃培養(yǎng)18～24h。有些細菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸而產生靛基質，靛基質無色，不能直接查見，此時滴加數滴靛基質試劑(Kovacs試劑)于培養(yǎng)基的液面上，其接觸面呈玫瑰紅色者為陽性，仍呈黃色者為陰性，若顏色不明顯，可再加4～5滴乙醚，振蕩試管使乙醚分散于液體中，若培養(yǎng)液中有靛基質存在，就可以被提取至乙醚層中，顏色反應較為明顯。 (注)Kofacs試劑：取對二甲基氨基苯甲醛(Paradimethylamino benzaldehyde)4g，加95％酒精380ml，濃鹽酸80ml即成。 ② 甲基紅試驗(Methyl red test) 將細菌接種于葡萄糖蛋白胨水中，37℃培養(yǎng)48h后，再向其中加入甲基紅試劑3滴。大腸桿菌等細菌分解葡萄糖產生丙酮酸，但丙酮酸不被縮合成乙酰甲基甲醇，培養(yǎng)基中酸多，pH值低，故呈紅色，為陽性。而產氣桿菌將丙酮酸縮合成乙酰甲基甲醇，培養(yǎng)基中酸少，pH值高，故呈黃色，為陰性。 注：甲基紅試劑：，溶于60％的酒精100ml中。該試劑酸性時呈紅色，堿性時呈黃色。 ③ VP試驗(VogesProskauer test) 將細菌接種于葡萄糖蛋白胨水中，37℃培養(yǎng)48h后，再向培養(yǎng)基中加入等量的40％氫氧化鉀溶液(％肌酸)。產氣桿菌分解葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸又被縮合成乙酰甲基甲醇，后者遇堿被空氣中氧氧化，生成二乙酰，二乙酰又和培養(yǎng)基中的胍基化合物發(fā)生反應，生成紅色化合物，培養(yǎng)基變紅色，是為V—P試驗陽性，其他細菌不能生成乙酰甲基甲醇，培養(yǎng)基不變色，為陰性。 ④ 枸櫞酸鹽利用試驗(Utilization of citrate) 將細菌接種于枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48h。產氣桿菌等細菌能利用枸櫞酸鹽作為碳源，分解枸櫞酸鹽生成碳酸鹽，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，培養(yǎng)基中的指示劑由淡綠色轉為深藍色，為枸櫞酸鹽利用試驗陽性。大腸桿菌則不能分解枸櫞酸鹽，培養(yǎng)基顏色不變，為陰性。 3．硫化氫產生試驗(Production of