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正文內(nèi)容

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義(新)(編輯修改稿)

2025-05-01 23:49 本頁(yè)面
 

【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 光闌, 用帶相板的物鏡代替普通物鏡,并帶有一個(gè)合軸用的望遠(yuǎn)鏡。 相差是指同一光線經(jīng)過折射率不同的介質(zhì)其相位發(fā)生變化并產(chǎn)生的差異。相位指在某一時(shí)間上,光的波動(dòng)所達(dá)到的位置。一般由于被檢物體(如不染色的細(xì)胞)所能產(chǎn)生的相差太小,肉眼很難分辨, 只有在變相差為振幅差(明暗差)之后才能被區(qū)分。相差決定于光波所通過介質(zhì)的折射率之差及其厚度,等于折射率與厚度的乘積之差(即光程之差)。而相差顯微鏡就是利用被檢物的光程之差進(jìn)行鏡檢的。相差顯微鏡與普通光鏡的不同之處在于它有四個(gè)特殊結(jié)構(gòu):相差物鏡、具有環(huán)狀光闌的轉(zhuǎn)盤聚光器、合軸調(diào)中望遠(yuǎn)鏡和綠色的濾光片。生物學(xué)中使用的多為明反差相差顯微鏡。 原理是利用物體不同結(jié)構(gòu)成分之間的折射率和厚度的差別,把通過物體不同部分的光程差轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹ü鈴?qiáng)度)的差別,經(jīng)過帶有環(huán)狀光闌的聚光鏡和帶有相位片的相差物鏡實(shí)現(xiàn)觀測(cè)的顯微鏡。主要用于觀察活細(xì)胞或不染色的組織切片,有時(shí)也可用于觀察缺少反差的染色樣品。把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差,從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度,使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射,偏離了原來的光路,同時(shí)被延遲了1/4λ(波長(zhǎng)),如果再增加或減少1/4λ,則光程差變?yōu)?/2λ,兩束光合軸后干涉加強(qiáng),振幅增大或減下,提高反差。在構(gòu)造上,相差顯微鏡有不同于普通光學(xué)顯微鏡4個(gè)特殊之處:① 環(huán)形光闌(annular diaphragm) 位于光源與聚光器之間,作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐,焦聚到標(biāo)本上。  ?、?相位板(annular phaseplate)在物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板,可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種:+相板:將直射光推遲1/4λ,兩組光波合軸后光波相加,振幅加大,標(biāo)本結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變亮,形成亮反差(或稱負(fù)反差)。+相板:將衍射光推遲1/4λ,兩組光線合軸后光波相減,振幅變小,形成暗反差(或稱正反差),結(jié)構(gòu)比周圍介質(zhì)更加變暗。  ?、?合軸調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡:用于調(diào)節(jié)環(huán)狀光闌的像與相板共軛面完全吻合。 2. 操作:(演示) ① 將燈室光圈和聚光鏡光圈都開至最大。 ② 首先將聚光鏡轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)至“0”,將待觀察標(biāo)本放置 載物臺(tái)上,正確利用精調(diào)節(jié)輪使之獲得清晰圖像。 ③ 取下目鏡,換上中心調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡. 握住望遠(yuǎn)鏡身, 轉(zhuǎn)動(dòng)鏡身上的黑帽以伸 長(zhǎng)望遠(yuǎn)鏡,直至獲得一清晰的相板影相(黑環(huán))。 ④ 將聚光鏡上的相差選擇轉(zhuǎn)盤調(diào)至“20”位, 使之與使用的20x物鏡相一致. 此時(shí)可見到另一個(gè)亮環(huán)。這是轉(zhuǎn)盤上相環(huán)的影像, 用相環(huán)中心調(diào)節(jié)鈕使亮 環(huán)和黑環(huán)重合。 ⑤ 取下中心調(diào)節(jié)望遠(yuǎn)鏡, 換上目鏡, 即可得到標(biāo)本(動(dòng)物細(xì)胞,自己做樣品片) 的相差鏡像。 ⑥ 用滴管吸取活細(xì)胞懸液滴在載玻片上,將蓋玻片封好, 避免產(chǎn)生氣泡。 ⑦ 觀察培養(yǎng)的活細(xì)胞。 3. 在進(jìn)行顯微鏡操作的任何時(shí)段都禁止用手觸摸鏡頭, 也不要將鏡頭碰到蓋玻 片。(二)熒光顯微鏡的構(gòu)造、原理和使用方法 1. 原理落射光激發(fā)的熒光法(incidentlight fluorescence EpiFL) 是近代顯微 鏡檢術(shù)中新發(fā)展出來的一種強(qiáng)有力的反差增強(qiáng)法。它將激發(fā)熒光用的光源改在物鏡的上方,光由物鏡上方經(jīng)反光鏡射入物鏡去激發(fā)樣品,從樣品上被激發(fā)的熒光經(jīng)物鏡成像并穿透反光鏡而由目鏡觀察。該方法較簡(jiǎn)便,效率高,50W的光源強(qiáng)度比透射熒光法的250W還強(qiáng)。熒光方法是利用波長(zhǎng)較短的紫外光、紫光、藍(lán)紫光、藍(lán)光及綠光等去激發(fā)樣品,只要樣品中含有可產(chǎn)生熒光的成分,它便吸收短波的激發(fā)光而釋放出波長(zhǎng)較長(zhǎng)的熒光。不同物質(zhì)只能吸改特定波長(zhǎng)的激發(fā)光,而釋放的熒光也會(huì)有特定的波 長(zhǎng),因而 用作特異性的鑒定十分有效,如某些致病的細(xì)菌和螺旋體,受紫外光 激發(fā)后能發(fā)出它們特有的熒光,很容易作出鑒定,這種利用物質(zhì)吸收激發(fā)光后放出特有熒光的方法稱為自發(fā)熒光法。某些物質(zhì)自身不會(huì)吸收激發(fā)光,或吸收后不能釋放熒光,但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料,而這些特定的熒光色素或染料也只能吸收特定的激發(fā)光,再釋放出特定的熒光,從而間接地鑒別出某種物質(zhì),這稱為間接熒光法。上述熒光方法廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及工業(yè)的特異性研究和鑒別上。 熒光顯微鏡就其光路來分有兩種:① 透射式熒光顯微鏡: 激發(fā)光源是通過聚光鏡穿過標(biāo)本材料來激發(fā)熒光的。常用暗視野集光器,也可用普通集光器,調(diào)節(jié)反光鏡使激發(fā)光轉(zhuǎn)射和旁射到標(biāo)本上.這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優(yōu)點(diǎn)是低倍鏡時(shí)熒光強(qiáng),而缺點(diǎn)是隨放大倍數(shù)增加其熒光減弱.所以對(duì)觀察較大的標(biāo)本材料較好。② 落射式熒光顯微鏡這是近代發(fā)展起來的新式熒光顯微鏡,與上不同處是激發(fā)光從物鏡向下落射到標(biāo)本表面,即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個(gè)雙色束分離器,它與光鈾呈45度角,激發(fā)光被反射到物鏡中,并聚集在樣品上,樣品所產(chǎn)生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發(fā)光同時(shí)進(jìn)入物鏡,反回到雙色束分離器,使激發(fā)光和熒光分開,殘余激發(fā)光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發(fā)濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的組合插塊,可滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。此種熒光顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是視野照明均勻,成像清晰,放大倍數(shù)愈大熒光愈強(qiáng)。 2. 熒光顯微鏡使用方法.① 打開燈源,超高壓汞燈要預(yù)熱幾分鐘才能達(dá)到最亮 點(diǎn)。② 透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片,在 物鏡的后面裝上相應(yīng)的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所 要求的激發(fā)濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的插塊。 3. 用低倍鏡觀察,根據(jù)不同型號(hào)熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置,調(diào)整光源中心,使其 位于整個(gè)照明光斑的中央。 4. 放置標(biāo)本片,調(diào)焦后即可觀察。使用中應(yīng)注意:未裝濾光片不要用眼直接觀 察,以免引起眼的損傷;用油鏡觀察標(biāo)本時(shí),必須用無熒光的特殊油鏡;高 壓汞燈關(guān)閉后不能立即重新打開,需經(jīng)5分鐘后才能再啟動(dòng),否則會(huì)不穩(wěn)定, 影響汞燈壽命。 5. 觀察:在示教臺(tái)上的熒光顯微鏡下用藍(lán)紫光濾光片,%的丫啶橙 熒光染料染色的細(xì)胞,細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光(暗綠 色和橙紅色)。 6. 熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求: ① 載玻片 — mm之間,太厚的坡片,一方面光吸收多,另一方 面不能使激發(fā)光在標(biāo)本上聚集。載玻片必須光潔,厚度均勻,無明顯自發(fā)熒 光。有時(shí)需用石英玻璃載玻片。 ② 蓋玻片 mm左右,光潔。為了加強(qiáng)激發(fā)光,也可用干涉蓋玻片, 這是一種特制的表面鍍有若干層對(duì)不同波長(zhǎng)的光起不同干涉作用的物質(zhì)(如 氟化鎂)的蓋玻片,它可以使熒光順利通過,而反射激發(fā)光,這種反射的激發(fā) 光女可激發(fā)標(biāo)本。 ③ 標(biāo)本 組織切片或其他標(biāo)本不能太厚,如太厚激發(fā)光大部分消耗在標(biāo)本下部,而物 鏡直接觀察到的上部不充分激發(fā)。另外,細(xì)胞重迭或雜質(zhì)掩蓋,影響判斷。 ④ 封裱劑 封裱劑常用甘油,必須無自發(fā)熒光,無色透明,— 較亮,不易很快褪去。所以,~ 液的等量混合液作封裱劑。 ⑤ 鏡油 一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標(biāo)本時(shí),必須使用鏡油,最好使用特制 的無熒光鏡油,也可用上述甘油代替,液體石蠟也可用,只是折光率較低, 對(duì)圖像質(zhì)量略有影響。 7. 使用熒光顯微鏡的注意事項(xiàng): ① 嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作,不要隨意改變程序。 ② 應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后,接上電源,點(diǎn)燃超高壓汞燈5—15 min, 待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后,眼睛完全適應(yīng)暗室,再開始觀察標(biāo)本。 ③ 防止紫外線對(duì)眼睛的損害,在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。 ④ 檢查時(shí)間每次以1—2 h為宜,超過90 min,超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降, 熒光減弱;標(biāo)本受紫外線照射3—5 min后,熒光也明顯減弱;所以,最多不 得超過2—3 h。 ⑤ 熒光顯微鏡光源壽命有限,標(biāo)本應(yīng)集中檢查,以節(jié)省時(shí)間,保護(hù)光源。天熱 時(shí),應(yīng)加電扇散熱降溫,新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再 用時(shí),須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。 ⑥ 標(biāo)本染色后立即觀察,因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑 料袋中4 ℃保存,可延緩熒光減弱時(shí)間,防止封裱劑蒸發(fā)。 8. 熒光圖像的記錄方法 熒光顯微鏡所看到的熒光圖像,一是具有形態(tài)學(xué)特征,二是具有熒光的顏色和亮度,在判斷結(jié)果時(shí),必須將二者結(jié)合起來綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo),即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察,基本上可靠的。隨著技術(shù)科學(xué)的發(fā)展,在不同程度上采用客觀指標(biāo)記錄判斷結(jié)果,如用細(xì)胞分光光度計(jì),圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果,也必須結(jié)合主觀的判斷。熒光顯微鏡攝影技術(shù)對(duì)于記錄熒光圖像十分必要,由于熒光很易褪色減弱,要即時(shí)攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24以上。因紫外光對(duì)熒光猝滅作用大,如FITC的標(biāo)記物,在紫外光下照射30 s,熒光亮度降低50 %。所以,曝光速度太慢,就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動(dòng)或全自動(dòng)顯微攝影系統(tǒng)裝置。標(biāo)本的制作方法樣品須經(jīng)過石蠟包埋切片,然后用鐵礬蘇木精染色,普通光鏡觀察效果還可以. 實(shí)驗(yàn)建議1. 嚴(yán)格按照熒光顯微鏡廠家說明書要求進(jìn)行操作,不要隨意改變程序。2. 觀察對(duì)象必須是可自發(fā)熒光或已被熒光染料染色的標(biāo)本。3. 應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后,接上電源,點(diǎn)燃超高壓汞燈5—15 min, 待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后,眼睛完全適應(yīng)暗室,再開始觀察標(biāo)本。4. 載玻片、蓋玻片及鏡油應(yīng)不含自發(fā)熒光雜質(zhì),— mm 之間,太厚可吸收較多的光,并且不能使激發(fā)光在標(biāo)本平面上聚焦。載玻片 必須光潔,厚度均勻,無油漬或劃痕。 mm左右。5. 防止紫外線對(duì)眼睛的損害,在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。6. 選用效果最好的濾光片組。7. 檢查時(shí)間每次以1—2 h為宜,超過90 min,超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降, 熒光減弱;標(biāo)本受紫外線照射3—5 min后,熒光也明顯減弱;所以,最多 不得超過2—3 h。8. 熒光標(biāo)本一般不能長(zhǎng)久保存,若持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間照射(尤其是紫外線)易很快褪 色。因此,如有條件則應(yīng)先照相存檔,再仔細(xì)觀察標(biāo)本。9. 熒光顯微鏡光源壽命有限,啟動(dòng)高壓汞燈后,不得在15 min內(nèi)將其關(guān)閉, 一經(jīng)關(guān)閉,必須待汞燈冷卻后方可再開啟。嚴(yán)禁頻繁開閉,否則,會(huì)大大降 低汞燈的壽命。標(biāo)本應(yīng)集中檢查,以節(jié)省時(shí)間,保護(hù)光源。天熱時(shí),應(yīng)加電 扇散熱降溫,新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí),須待 燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。 10. 標(biāo)本染色后立即觀察,因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯 塑料袋中4 ℃保存,可延緩熒光減弱時(shí)間,防止封裱劑蒸發(fā)。 11. 若暫不觀察標(biāo)本時(shí),可拉過阻光光簾阻擋光線。這樣,既可避免對(duì)標(biāo)本不 必要的長(zhǎng)時(shí)間照射,又減少了開閉汞燈的頻率和次數(shù)。 12. 熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn):一般分為四級(jí),即“一”—無或可見微弱熒光。 “+”—僅能見明確可見的熒光?!?+”—可見有明亮的熒光?!?++”—可 見耀眼的熒光。 13. 較長(zhǎng)時(shí)間觀察熒光標(biāo)本時(shí),一定要戴能阻擋紫外光的護(hù)目鏡,加強(qiáng)對(duì)眼睛 的保護(hù)。在未加入阻斷濾光片前不要用眼直接觀察,否則會(huì)損傷眼睛。 14. 激發(fā)光長(zhǎng)時(shí)間的照射,會(huì)發(fā)生熒光的衰減和淬滅現(xiàn)象,因此盡可能縮短觀 察時(shí)間,暫時(shí)不觀察時(shí),應(yīng)用擋板遮蓋激發(fā)光。 15. 熒光幾乎都較弱,應(yīng)在較暗的室內(nèi)進(jìn)行。 實(shí)驗(yàn)報(bào)告及作業(yè)1. 比較相差顯微鏡、熒光顯微鏡觀察結(jié)果的差異。2. 為什么相差顯微鏡可以直接觀察活體樣品。3. 實(shí)驗(yàn)體會(huì)。實(shí)驗(yàn)三 細(xì)胞膜的滲透性一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 了解細(xì)胞膜對(duì)物質(zhì)通透性的一般規(guī)律。2. 了解溶血現(xiàn)象及其發(fā)生機(jī)制。二、實(shí)驗(yàn)原理細(xì)胞膜是細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的選擇通透性屏障。它是一種半透膜,可選擇性控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。各種物質(zhì)出入細(xì)胞的方式是不同的,水是生物界最普遍的溶劑,水分子可以按照物質(zhì)濃度梯度從滲透壓低的一側(cè)通過細(xì)胞膜向滲透壓高的一側(cè)擴(kuò)散,這種現(xiàn)象就是滲透。滲透作用是細(xì)胞膜的主要功能之一。將紅細(xì)胞放在低滲鹽溶液中,水分子大量滲到細(xì)胞內(nèi),可使細(xì)胞脹破,血紅蛋白釋放到介質(zhì)中,由不透明的紅細(xì)胞懸液變?yōu)榧t色透明的血紅蛋白溶液,這種現(xiàn)象稱為溶血。將紅細(xì)胞放在某些等滲鹽溶液中,由于紅細(xì)胞膜對(duì)各種溶質(zhì)的通透性不同,膜兩側(cè)的滲透壓平衡會(huì)發(fā)生改變,也會(huì)發(fā)生溶血現(xiàn)象。因此,發(fā)生溶血現(xiàn)象所需時(shí)間長(zhǎng)短可作為測(cè)量物質(zhì)進(jìn)入紅細(xì)胞速度的一種指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)選用紅細(xì)胞作為細(xì)胞膜透性的實(shí)驗(yàn)材料,將其放入不同的介質(zhì)溶液中,觀察紅細(xì)胞的變化。三、實(shí)驗(yàn)用品(一) 材料 雞血細(xì)胞(二) 器材
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