3種植物花螺原體的分離及其基本特性-生物谷-生物醫(yī)藥門(mén)戶(編輯修改稿)
2025-05-01 23:02 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 CNA1Brassica napus++“+”means positive reaction, “”means negative reaction. 分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析采用Chelex100法提取得到足量的螺原體總DNA，利用通用引物成功擴(kuò)增出螺原體的長(zhǎng)度約1470 bp的16S rDNA片段，利用通過(guò)Primer bp的ITS片段。測(cè)序后將測(cè)得的4株螺原體序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果表明菌株CRW1 16S rDNA與S. chinense相似度最高，但其ITS序列與S. clarkii相似度最高；其它3個(gè)菌株無(wú)論是16S rDNA還是ITS序列都與S. melliferum相似度最高。同時(shí)對(duì)4個(gè)菌株之間的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)CRW1的16S rDNA與其它3個(gè)菌株的序列差異較大，而其它3個(gè)菌株間16S rDNA僅有幾個(gè)堿基的差異。將4株螺原體的16S rDNA序列在NCBI上比對(duì)，根據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建鄰接樹(shù)，發(fā)現(xiàn)CNRCNRCNA1與S. melliferum聚成一類，形成一個(gè)獨(dú)立的分枝；而CRW1與S. clarkii聚類。由于GenBank中S. clarkii序列的精確度不高，序列中有較多未知堿基，去除該序列和其它一些親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的序列，發(fā)現(xiàn)CRW1單獨(dú)形成一個(gè)分枝。相比之下，4個(gè)分離菌株的ITS序列變異較大，尤其是CRW1與其他3個(gè)菌株之間的ITS序列有較大差異。選擇不同血清組和不同血清亞組的標(biāo)準(zhǔn)菌株，從GenBank中下載相應(yīng)的ITS序列，經(jīng)整理用于系統(tǒng)發(fā)育分析的ITS序列長(zhǎng)度約310 bp，進(jìn)行初步分析后用于系統(tǒng)發(fā)育分析。根據(jù)ITS序列構(gòu)建的鄰接樹(shù)，以親緣關(guān)系較近的Mycoplasma hominis作為外群，結(jié)果顯示CRW1單獨(dú)形成一個(gè)分枝，而CNRCNR圖2 根據(jù)ITS序列構(gòu)建的螺原體發(fā)育樹(shù)(NJ法, 1500次)Fig. 2 Phylogenetic trees of ITS sequence showing the position of spiroplasma isolates based on neighborjoining (NJ) with 1500 bootstrap replication. Mycoplasma hominis ATCC 27545 was used as an outgroup strain. The numbers at the nodes indicate the bootstrap values. Bar, 1 nucleotide substitution per 100 nucleotides of ITS sequence. Strain names are shown next to the organism names and GenBank accession numbers for the ITS sequences used are given in parentheses.CNA1與S. melliferum、S. citri聚成一類（在根據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的鄰接樹(shù)中，CNRCNRCNA1 并不與S. citri聚類）(圖2)。根據(jù)16S rDNA和ITS序列構(gòu)建的最大簡(jiǎn)約樹(shù)和鄰接樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似。3 討論植物花表是螺原體主要存在場(chǎng)所之一，有報(bào)道證實(shí)花上螺原體與昆蟲(chóng)有密切關(guān)系，幾種植物花螺原體可能對(duì)昆蟲(chóng)致病[11]，然而植物花螺原體對(duì)植物的影響目前還不清楚。一般認(rèn)為植物花螺原體是通過(guò)媒介——主要是節(jié)肢動(dòng)物在取食花蜜時(shí)留下的[12]。由于昆蟲(chóng)取食的偶然性及取樣的隨機(jī)性，每種植物花上分離螺原體的概率不但與樣品量有關(guān)，還與植物的栽培面積、花本身的結(jié)構(gòu)如蜜腺的暴露程度、開(kāi)花時(shí)間是否與介體活動(dòng)時(shí)間吻合及采樣前天氣情況等相關(guān)。分離得到的螺原體菌株在生長(zhǎng)的某一階段（多數(shù)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）呈現(xiàn)典型的螺旋形（圖1）， mm孔徑的濾膜，對(duì)干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成的青霉素類抗生素有較強(qiáng)的抗性，在液體培養(yǎng)基中呈翻滾式運(yùn)動(dòng)，在R2固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為圓形或顆粒狀，這些特性完全符合Brown等對(duì)螺原體屬(Spiroplasma)形態(tài)的描述[1]。盡管少量螺原體如S. floricola, S. gladiatoris在生長(zhǎng)過(guò)程中并不需要甾醇[13,14]，但是本研究中分離得到的4株螺原體在不含血清的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，說(shuō)明這幾株菌在生長(zhǎng)過(guò)程中需要利用血清中的甾醇（表1）。分離得到的菌株均能利用葡萄糖作為碳源，不能利用尿素（表1），這些也是螺原體屬的特性[4,15]。但是對(duì)精氨酸的代謝能力，不同菌株差異很大（表1），CNR2和CRW1不能代謝精氨酸，CNRCNA1能強(qiáng)烈代謝精氨酸，而蜜蜂螺原體S. melliferum也能代謝精氨酸，說(shuō)明菌株CNR2和CRW1的代謝特性與S. melliferum有一定差異。螺原體的分類一直依賴于血清學(xué)分析，而大量的研究表明，基于16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)反映出的螺原體親緣關(guān)系與經(jīng)典的血清學(xué)反應(yīng)的關(guān)系一致[1,4,13]，因而在螺原體的分類鑒定中日益重要。基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)與基于16S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)基本一致，但對(duì)于血清組Ⅰ和血清組Ⅷ中的不同亞組ITS序列的分辨率(resolving power)更 好[4]。將已分離菌株的16S rDNA序列和ITS序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示16S rDNA序列較為保守，而ITS序列無(wú)論是核苷酸數(shù)量還是組成上都有明顯差異。無(wú)論16S rDNA還是ITS，CNRCNRCNA1之間的差異都較小，而CRW1與這3株螺原體的差異較大（圖2），說(shuō)明分離自紅花酢漿草的螺原體CRW1與蜜蜂螺原體Spiroplasma melliferum和其它3株植物花的螺原體有明顯的差異。從基于16S rDNA和ITS序列構(gòu)建的鄰接樹(shù)中可以看出，螺原體CNRCNRCNA1都與
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