植物細胞工程課件第三章細胞克隆與種子細胞篩選(編輯修改稿)
2025-02-16 07:37 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 培養(yǎng) 蛋白酶溶液消化 機械方法吹打組織塊 離心、培養(yǎng)液懸浮 計數(shù)、調(diào)節(jié)細胞密度 用于分離細胞培養(yǎng) 動物細胞的培養(yǎng)步驟 例 1 乳鼠腎細胞原代培養(yǎng) 準備工作 A． 培養(yǎng)用品消毒后，安放在超凈工作臺內(nèi)，紫外線消毒，做好洗手等準備工作。 B． 點燃酒精燈，用品按布局放置，安裝吸管等。 乳鼠腎細胞原代培養(yǎng) a. 采用頸椎脫臼法 ， 將一只新生乳鼠處死 b. 將 小 鼠 放 入 盛 有 酒 精 的 燒 杯 中 數(shù) 秒 c. 置超凈工作臺內(nèi) d. 打開消毒器械包 用鑷子掀起乳鼠腹部皮膚 ,用 解 剖 剪 剪 開 腹 腔 , 充 分 暴 露 腹 腔 e. 用另一鑷子輕輕夾起腸管 ,翻置一側(cè) ,充分暴露位于腹腔背壁脊柱 f. 取下雙側(cè)腎臟 ,放入消毒培養(yǎng)皿中 g. 用吸管吸取 PBS加入培養(yǎng)皿中 ,清洗腎臟 3次 ,盡量去掉血污 . h. 將腎組織用解剖剪剪成幾塊，再用 PBS漂洗，去凈血液 . ,用眼科剪剪切至 。 58倍體積的 %胰蛋白酶，蓋好放入37℃ 水浴中消化 2030分鐘 ,注意應每隔 5分鐘振搖一次。 ,顏色略白時，取出置于超凈工作臺內(nèi) . 胰蛋白酶消化 ,使大部分組織塊分散成細胞團或單個細胞狀態(tài)。 12ml培養(yǎng)液終止消化，凈置片刻，讓未消化完的組織塊自然下沉 ,將上部的組織懸液移入無菌離心管中。 810min, 取上清加入適量培養(yǎng)液 ,細胞計數(shù)后分裝； (板 )上標明細胞名稱，代數(shù)，日期； 37℃ 孵箱中培養(yǎng)。 離心及計數(shù) 培養(yǎng)細胞每天觀察，檢查： ? 。 細胞觀察 ? 如見培養(yǎng)液變?yōu)辄S色且又混濁 ， 為污染 。如培養(yǎng)液為桔紅色 ， 表明細胞狀況良好 。在無污染時 ， 24h內(nèi)有細胞貼壁 ， 圓形懸浮狀的細胞延展成短梭狀 。 培養(yǎng) 34天 ， 細胞生長繁殖 ， 可見細胞島形成 。 細胞透明 ， 顆粒少 ， 界線清 。 由于細胞生長旺盛 ， 代謝產(chǎn)物堆積 ， CO2增多 ， 培養(yǎng)液逐漸變酸呈黃色 ， 但液體澄清 ，此時應換液 。 例二 魚類細胞培養(yǎng) 魚類原代細胞的培養(yǎng) A 斷尾（或剪腮）放血 B 用 ％高錳酸鉀溶液或 70％的乙醇浸泡消毒 30分鐘。 C 70％酒精棉球擦洗解剖部位 D 剖開腹腔，取出組織，清除粘膜和血液，剪碎，維持液 (Hanks液 )或緩沖液 (PBS)洗。 E 用 ％胰酶消化 (20℃ ， 30’或 4℃ ， 過夜 ) F 離心 (1000rpm, 10’), 棄去消化液 G 用培養(yǎng)基重懸，計數(shù)，分裝培養(yǎng) (應在2x104個細胞 /ml 以上 )。 A 長成單層的細胞棄去培養(yǎng)基，加胰酶－EDTA，消化后棄去消化液 B 加培養(yǎng)基，吹打分散 C 分裝培養(yǎng) 傳代細胞的
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