【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 L茶氨酸、尼古丁受體抑制劑 DHβE溶于生理鹽水 , 采用皮下注射方式給藥 。 小鼠按以下方式分組 , 每組 10 只 . 對(duì)照組 : 小鼠皮下注射生理鹽水 。 尼古丁組 : 皮下注射尼古丁 ( mg/kg/天 )。 ThL, L茶氨酸低劑量組 : 小鼠皮下注射 L茶氨酸 (250 mg/kg/天 )。 ThH, L茶氨酸高劑量組 : 小鼠皮下注射 L茶氨酸 (500 mg/kg/天 )。 ThL(N), 尼古丁和 L茶氨酸低劑量組 : 小鼠皮下注射 L茶氨酸 (250 mg/kg/天 ) 15 min 后皮下注射尼古丁 ( mg/kg/天 )。 ThH (N), 尼古丁和 L茶氨酸高劑量組 : 小鼠皮下注射 L茶氨酸 (500 mg/kg/天 ) 15 min 后皮下注射尼古丁 ( mg/kg/天 )。 DHβE(N), 尼古丁和抑制劑組 : 小鼠皮下注射抑制劑 ( mg/kg/天 )15 min后皮下注射尼古丁( mg/kg /天 )[17]. 動(dòng)物每日注射尼古丁 ( mg/kg/天 )或生理鹽水連續(xù)不同時(shí)間 . 擬南芥 Fbox基因 FOA1參與 ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) ABA 和 NaCl 處理 、 種子萌發(fā)及根長(zhǎng)分析 將擬南芥種子用 75%酒精浸泡 30 s, 然后用 10%NaClO 浸泡 10 min, 無(wú)菌水清洗 4~6 次后 , 置于 4℃ 黑暗環(huán)境春化 4 天 , 分別用于 ABA 和 NaCl 處理 、 種子萌發(fā)及根長(zhǎng)分析 . (1) ABA和 NaCl 處理 . 用 %的瓊脂糖懸浮種子 , 均勻點(diǎn)播于 MS 固體培養(yǎng)基 (含 %瓊脂 )上 , 轉(zhuǎn)移至溫度為 22~23℃ , 光強(qiáng)為 50 μmol s 1 m 2 的全日照培養(yǎng)箱 . 14 天后 , 將野生型 Col0 幼苗的根泡在含 ABA(10 μmol/L)或 NaCl(100 mmol/L)的MS液體培養(yǎng)基中分別處理 0, 1, 2, 4, 6 和 8 h, 用于分析外源 ABA和 NaCl 對(duì) FOA1 基因表達(dá)的調(diào)節(jié) 。 此外 , 將野生型 Col0 和foa1 突變體幼苗同時(shí)用含 ABA(100 μmol/L)的液體培養(yǎng)基處理 0 和 6 h, 用于比較分析 ABA 及脅迫應(yīng)答基因在野生型和 foa1 突變體中的表達(dá)變化情況 . 處理材料收集后放入液氮速凍 , 80℃ 保存用于 RNA 提取和基因表達(dá)分析 . (2) 種子萌發(fā)分析 . 用 %的瓊脂糖懸浮種子 ,均勻點(diǎn)播于含不同濃度 ABA(0, , )的 MS固體培養(yǎng)基 (含 %瓊脂 )表面 , 轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)室 . 于第 5 天統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率 . 結(jié)果取 3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值 177。 標(biāo)準(zhǔn)誤差 , 每次實(shí)驗(yàn)約統(tǒng)計(jì) 100 粒種子的萌發(fā)率 . (3) 根長(zhǎng)分析 . 用 %的瓊脂糖懸浮種子 , 均勻點(diǎn)播于 MS 固體培養(yǎng)基上 , 在培養(yǎng)箱培養(yǎng) 3 天后 ,將幼苗移植到含不同濃度ABA(0, 5, 10 μmol/L)的 MS固體培養(yǎng)基 (含 %瓊脂 )表面 , 繼續(xù)培養(yǎng) 6 天后 ,測(cè)其根長(zhǎng) . 結(jié)果取 3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值 177。 標(biāo)準(zhǔn)誤差 ,每處理統(tǒng)計(jì) 20 棵幼苗根的長(zhǎng)度 . 氣孔觀察與氣孔開(kāi)度的測(cè)定 參照 Pei 等人的研究方法 [24], 取生長(zhǎng)在同一條件下 4~5 周齡大的野生型 、 缺失突變體 、 過(guò)量表達(dá)植株的蓮座葉 , 在氣孔開(kāi)放緩沖液中 (10 mmol/L KCl, , 10 mmol/L 乙磺酸 , 10 mmol/LTrisHCl, pH )浸泡 10 h 使氣孔充分開(kāi)放 , 然后加入不同濃度 (0, 1 和 10 μmol/L)ABA 繼續(xù)浸泡 2 h, 在倒置顯微鏡 (NICON TE2022)下測(cè)定葉片下表皮氣孔縱橫徑 , 并拍照 . 每個(gè)處理重復(fù) 3 次 . 蒸騰失水速率的測(cè)定 參照 Shan 等人 [25]的方法 , 取約 3 周齡大的野生型 、 缺失突變體 、 過(guò)量表達(dá)植株的蓮座葉各 4 片稱取其初重 , 放在室溫25℃ 、 60%濕度的環(huán)境下干燥 , 每隔 30 min 稱重 1 次 , 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)后計(jì)算蒸騰失水率 . 每個(gè)材料重復(fù) 3 次 . 詳細(xì)描述自創(chuàng)方法 多種處理的描述 低磷脅迫水稻根部基因表達(dá)譜研究 實(shí)驗(yàn)材料 以水稻品種中早 18(indica)為材料 . 中早 18 種子浸種 、 催芽后 , 轉(zhuǎn)入營(yíng)養(yǎng)液水培 , 營(yíng)養(yǎng)液中各營(yíng)養(yǎng)元素含量分別為 : mmol/L NH4NO3, mmol/LNaH2PO4, mmol/L K2SO4, mmol/L CaCl2, , mmol/L NaSiO3, 50 μmol/L FeEDTA, μmol/L (NH4)6Mo7O24, 15 μmol/L H3BO3, 8 μmol/L MnCl2, μmol/L CuSO4, μmol/L ZnSO4, 29 μmol/L FeCl3, μmol/L Citric acid, pH . 3 天換一次營(yíng)養(yǎng)液 . 水培至四葉一心 時(shí)進(jìn)行低磷脅迫處理 (低磷營(yíng)養(yǎng)液中磷的濃度為上述 營(yíng)養(yǎng)液濃度的 1/30, 其他成分不變 ), 對(duì)照材料營(yíng)養(yǎng)液不變 . 設(shè)置 3 次生物學(xué)重復(fù) , 即種植 3 批材料 , 每批材料種植時(shí)間間隔 5 天 。 自制試劑 低磷脅迫水稻根部基因表達(dá)譜研究 microarray 熒光探針的標(biāo)記、雜交、洗脫和掃描 中早 18 處理和對(duì)照材料 mRNA 各取 μg 作為模板 , 在 400 U SuperscriptⅡ 反轉(zhuǎn)錄酶 (Invitrogen, Carlsbad, CA)催化下加入 μg Oligo dT(18)(Takara, Japan), 40 μL 反應(yīng)體系中包含 10 mmol/L DTT, 40 U RNase 抑制劑 (Promega, Madison, Wisconsin, USA), dATP, dCTP 和 dGTP 各 500 μmol/L, dTTP 和 aadUTP各 200 μmol/L (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) 以及 1 第一鏈合成緩沖液 . 在 42℃ 反應(yīng) 3 h 合成 cDNA 第一鏈 , 隨后 94℃ 變性3 min 終止反應(yīng) , 加入 RNaseH(Promega, Madison, WI), 然后 37℃ 反應(yīng) 15 min 去除 mRNA, 酚 /氯仿抽提反應(yīng)混合物 , YM30 柱 (Millipore,USA) 純化產(chǎn)物 . …… 縮寫(xiě)： cDNA合成體系 40 μL， 包含 μg mRNA， …… .。 42℃ 反應(yīng) 3 h ， 94℃ 3 min 終止反應(yīng) ， 加入RNaseH (Promega, Madison, WI), 37℃ 反應(yīng) 15 min 后 酚 /氯仿抽提 ， 產(chǎn)物 過(guò) 柱 (YM30, Millipore, USA) 純化 。 注意 繁瑣 水稻多小花小穗突變體 mf1的鑒定與基因定位 基因定位 采用 BSA法定位目標(biāo)基因 [14], 即根據(jù) F2植株表型 , 分別選取 10株正常單株和 10株突變單株 , 剪取等量葉片 , 構(gòu)成正常基因池和突變基因池 。 按 CTAB法提取親本和基因池 DNA[15], 按堿煮法提取群體 DNA[16]。 SSR引物序列參照 /microsat/, 由上海生工生物技術(shù)公司合成 。 PCR總體系為 25 μL, 含 μL 10 PCR buffer、 μL 25 mmol L1 MgC1 μL mmol L1 dNTPs、 μL ddH2O、 μL 10 μmol L1引物 、 μL模板 DNA、 μL 5 U μL1 Taq酶 。 PCR程序?yàn)?, 94℃ 預(yù)變性 5 min。 94 ℃ 變性 30 s, 55℃ 退火 30 s, 72℃ 復(fù)性 1 min, 35個(gè)循環(huán) 。 72℃ 延伸 10 min。 PCR產(chǎn)物經(jīng) 10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 , 快速銀染后觀察 [1617]。 圖譜構(gòu)建 將具有 mf1突變親本帶型的單株記為 B, 具有正常親本 IR24帶型的單株記為 A, 具有雜合帶型的單株記為 H, 用軟件 MMQTX18計(jì)算 遺傳距離 并構(gòu)建遺傳圖譜。根據(jù) gramene網(wǎng)站提供的水稻序列信息構(gòu)建物理圖譜。 篩選 親本及基因池 間表現(xiàn) 多態(tài) 性的 SSR標(biāo)記 ， 經(jīng)單株驗(yàn)證表現(xiàn)與突變性狀連鎖后用于 分析 F2群體中的 所有 突變單株 ， …… 連鎖標(biāo)記與突變位點(diǎn)之間的 注意 過(guò)于簡(jiǎn)化 水稻多小花小穗突變體 mf1的鑒定與基因定位 DNA的提取與 SSR分析 按 CTAB法提取親本和基因池 DNA[15], 按堿煮法提取群體 DNA[16]。 SSR引物序列參照 /microsat/, 由上海生工生物技術(shù)公司合成 。 PCR總體系為 25 μL, 含 μL 10 PCR buffer、 μL 25 mmol L1 MgC1 μL mmol L1 dNTPs、 μL ddH2O、 μL 10 μmol L1引物 、 μL模板 DNA、 μL 5 U μL1 Taq酶 。 PCR程序?yàn)?, 94℃ 預(yù)變性 5 min。 94 ℃ 變性 30 s, 55℃ 退火 30 s, 72℃ 復(fù)性 1 min, 35個(gè)循環(huán) 。 72℃ 延伸 10 min。 PCR產(chǎn)物經(jīng) 10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 , 快速銀染后觀察 [1617]。 基因定位 與 圖譜構(gòu)建 采用 BSA法定位目標(biāo)基因 [14], 即根據(jù) F2植株表型 , 分別選取 10株正常單株和 10株突變單株 , 剪取等量葉片 , 構(gòu)成