生物化學(xué)和分子生物學(xué)(1)(編輯修改稿)
2025-02-14 02:14 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 “縱向”體系 接 載體和目的基因的 連接 ? 即將帶有切口的載體與所獲得的目的基因連接起來，得到重新組合后的 DNA分子。 （一）粘性末端連接法： ? 當(dāng)載體 DNA和目的基因均用同一種限制酶進(jìn)行切斷時(shí)，二者即可帶有相同的粘性末端。如將載體與目的基因混合在一起，二者即可通過粘性末端進(jìn)行互補(bǔ)粘合，再加入 DNA連接酶，即可封閉其缺口，得到重組體。 ? 較少的情況下，對(duì)產(chǎn)生的平端也可直接進(jìn)行連接。 載體 DNA與目的基因的連接 （二）人工接尾法： ? 即同聚物加尾連接法。當(dāng)載體和目的基因無法采用同一種限制酶進(jìn)行切斷，無法得到相同得粘性末端時(shí)，可采用此方法。 ? 此法首先使用單鏈核酸酶將粘性末端切平，再在末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下，將脫氧核糖核苷酸添加于載體或目的基因的 339。端，如載體上添加一段 polyG，則可在目的基因上添加一段 polyC，故二者即可通過堿基互補(bǔ)進(jìn)行粘合，再由 DNA連接酶連接。 （三）人工接頭連接法： ? 將人工連接器（ linker,即一段人工合成的含有多種限制酶切點(diǎn)的小分子 DNA片段 ,約 10~20個(gè)核苷酸， ）連接到平末端 DNA分子 (載體和目的基因 )上，即有可能使用同一種限制酶對(duì)載體和目的基因進(jìn)行切斷，得到可以互補(bǔ)的粘性末端。 ? 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)。 DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽性克?。? 表（達(dá)目的基因） “縱向”體系 轉(zhuǎn) 重組體的轉(zhuǎn)化 受體細(xì)胞 重組體的轉(zhuǎn)化 宿主菌或受體細(xì)胞 ②真核系統(tǒng) 酵母菌酵母 昆蟲細(xì)胞 哺乳動(dòng)物細(xì)胞 ①原核系統(tǒng) 大腸桿菌 枯草桿菌 原核細(xì)胞的轉(zhuǎn)化（細(xì)菌轉(zhuǎn)化） 受體細(xì)胞的選擇 限制缺陷型 : 避免修飾和降解 重組缺陷型： 避免重組整合 轉(zhuǎn)化親和型： 較高的可轉(zhuǎn)化性 遺傳互補(bǔ)型： 利于篩選 感染缺陷型： 防止感染 感受態(tài)細(xì)胞（ petent cell） ? 所謂感受態(tài)， 就是細(xì)菌吸收轉(zhuǎn)化因子的生理狀態(tài)。 ? 如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源 DNA。 ? 受體細(xì)胞經(jīng)過一些特殊方法 (如電擊法 ,CaCl2等化學(xué)試劑法 )的處理后 ,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變 ,成為能允許外源 DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞(Competent cells)。 大腸桿菌細(xì)胞 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 得到噬菌斑或單菌落 與重組 DNA共同冰浴 而后 42℃ 短暫熱刺激 CaCl2處理 受體細(xì)菌 50100mmol/L CaCl2 感受態(tài)細(xì)菌 重組體轉(zhuǎn)入細(xì)菌 轉(zhuǎn)化 ?：在高壓電場(chǎng)下使細(xì)胞產(chǎn)生瞬間的穿孔，這個(gè)穿孔足夠大并可維持足夠的時(shí)間，使外源 DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。電穿孔法的轉(zhuǎn)化效率比鈣轉(zhuǎn)化法高 2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。這種方法也可用于真核生物的轉(zhuǎn)染。 轉(zhuǎn)化方法 真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 受體細(xì)胞系統(tǒng) 永生細(xì)胞系 細(xì)胞特異性的選擇標(biāo)記 對(duì)抗某種藥物 ?電穿孔法：原理與原核生物的電穿孔法一樣。 轉(zhuǎn) 染 方法 ?磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)：主要用于動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。將 DNA溶液加入到CaCl2中，然后在強(qiáng)烈震蕩下加入由 Na2HPO4和 NaH2PO4組成的磷酸緩沖液，使溶液產(chǎn)生磷酸鈣沉淀并將 DNA包裹在沉淀中。將這些沉淀加入到細(xì)胞中，利用細(xì)胞的胞飲作用將 DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中。磷酸鈣一方面可以增加細(xì)胞的通透性，一方面可以避免 DNA被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶水解。 磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染 重組體 + 磷酸鈣微粒 內(nèi)吞作用 重組體進(jìn)入細(xì)胞 大顆粒 ?基因槍轉(zhuǎn)染法：利用被電場(chǎng)或機(jī)械加速的金屬微粒能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的基本原理，先將 DNA溶液與鎢、金等金屬微粒一起保溫，使 DNA吸附在金屬微粒表面，隨高速的金屬微粒直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 ?激光微束穿孔法：利用直徑很小、能量很高的激光束在細(xì)胞表面引起可逆性的穿孔，使 DNA進(jìn)入細(xì)胞。 ?顯微注射法：利用毛細(xì)管直接將 DNA注入細(xì)胞內(nèi)。 ?脂質(zhì)體（ liposome）介導(dǎo)法：將 DNA包裹在人工制備的磷脂雙分子層的膜狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，通過脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合而將 DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。 ?多聚物介導(dǎo)法：利用多聚物如 PEG、二乙胺乙基葡聚糖（ DEAE葡聚糖）、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等與二價(jià)陽離子、 DNA混合形成沉淀顆粒，通過細(xì)胞的胞飲作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 DNA重組的基本模式 分（離目的基因）
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