生物化學(xué)第7章蛋白質(zhì)的分離、純化和表征(編輯修改稿)
2025-02-14 02:01 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 RTvMr ?? ??， ， 22ln)1(2dxcdvRTMr ????沉降平衡法 Ⅳ 積分并代入積分限得 )()/l n()1(22122122 xxccvRTMr ??? ?? 式中 ， c1, c2是距離旋轉(zhuǎn)軸心 x1, x2處的蛋白質(zhì)濃度 ， 通過離心機(jī)上的光學(xué)系統(tǒng)可以測出這兩個數(shù)據(jù) 。 將各種數(shù)據(jù)代入上式可計(jì)算出蛋白質(zhì)的分子量 。 三、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) Ⅰ 蛋白質(zhì)溶液是一種分散系統(tǒng) ， 蛋白質(zhì)顆粒是分散相 ， 水是 分散介質(zhì) 。 根據(jù)分散相的分散程度可以把分散系統(tǒng)分為 3類：分散相質(zhì)點(diǎn)小于 1nm的為真溶液；大于 100nm的為懸濁液；介于 1～ 100nm之間的為膠體溶液 。 蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) Ⅱ 膠體溶液維持穩(wěn)定要滿足 3個條件：質(zhì)點(diǎn)大小在1～ 100nm之間；質(zhì)點(diǎn)帶有同種電荷 ， 互相排斥；質(zhì)點(diǎn)能與溶劑形成溶劑化層 ， 質(zhì)點(diǎn)之間不易聚集 。 一般情況下 ， 蛋白質(zhì)溶液滿足這些條件 。 蛋白質(zhì)溶液也和其它膠體系統(tǒng)一樣 ， 具有丁達(dá)爾效應(yīng) 、 布朗運(yùn)動以及不能透過半透膜等性質(zhì) 。 蛋白質(zhì)的沉淀 Ⅰ 當(dāng)破壞蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定條件時 ， 蛋白質(zhì)會發(fā)生沉淀 。 加入脫水劑除去蛋白質(zhì)的水化層 、 改變?nèi)芤旱?pH達(dá)到蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使其不帶同種電荷 、 加入電解質(zhì)破壞蛋白質(zhì)顆粒的雙電層 、 加熱使蛋白質(zhì)變性等都會使蛋白質(zhì)沉淀 。 蛋白質(zhì)的沉淀 Ⅱ 1． 鹽析法 （ 硫酸銨 、 硫酸鈉 、 氯化鈉等 ） 2． 有機(jī)溶劑沉淀法 （ 甲醇 、 乙醇 、 丙酮等 ） 3． 重金屬鹽沉淀法 （ Hg2+、 Pb2+、 Cu2+、 Ag+等 ） 4． 生物堿試劑和某些酸類沉淀法 （ 鞣酸 、 苦味酸 、鎢酸 、 KI 等 ， 三氯醋酸 、 磺基水楊酸 、 硝酸等 ） 5． 加熱變性沉淀 (少量鹽類促進(jìn)蛋白質(zhì)加熱凝固 ) 四、蛋白質(zhì)分離純化的一般原則 1． 前處理 ：先盡量除去不必要組織和部分 ， 破碎細(xì)胞使蛋白質(zhì)釋放出來 ， 加提取液溶解出蛋白質(zhì) ，離心得到粗提液 。 若要提取某細(xì)胞器中的蛋白質(zhì) ，也可通過差速離心先得到細(xì)胞器 ， 再提取 。 2． 粗分級分離 ：沉淀法 、 超濾法 。 3． 純化 ：運(yùn)用各種方法除去雜質(zhì) 。 不同離心場下沉降的細(xì)胞組分 相對離心場 (g) 時間 (min) 沉降的組分 1,000 5 真核細(xì)胞 4,000 10 葉綠體、細(xì)胞碎片、細(xì)胞核 15,000 20 線粒體、細(xì)菌 30,000 30 溶酶體、細(xì)菌細(xì)胞碎片 100,000 3~10h 核糖體 五、蛋白質(zhì)的分離純化方法 根據(jù)分子大小不同的純化方法 透析（ dialysis）和超濾（ ultrafiltration） 透析 超濾 磁力攪拌器 攪拌子 透析液 裝有蛋白溶液的透析袋 根據(jù)分子大小不同的純化方法 （密度梯度離心） 常用于生成密度梯度的介質(zhì)是蔗糖 、 聚蔗糖 （ Ficoll） ， 分離核酸時還常用 CsCl作為介質(zhì) 。 柱層析裝置圖 層析介質(zhì) （固定相） 蛋白質(zhì)樣品 流出液 洗脫液 （流動相） 多孔支持板 分離的蛋白質(zhì) 根據(jù)分子大小不同的純化方法 凝膠過濾的介質(zhì)：它們都是化學(xué)惰性較強(qiáng)的凝膠珠 ， 內(nèi)部是網(wǎng)孔 ， 不同規(guī)格的介質(zhì)有不同大小的網(wǎng)孔 ， 用于分離不同分子量范圍的蛋白質(zhì) 。 目前常用的介質(zhì)有交聯(lián)葡聚糖 （ Sephadex G） 、 聚丙烯酰胺凝膠 （ BioGel P） 、 瓊脂糖 （ Sepharose或 BioGel A） 等 。 （凝膠過濾層析） 凝膠過濾層析的原理 凝膠過濾層析的洗脫曲線 凝膠過濾法測蛋白質(zhì)的分子量 利用溶解度差別的純化方法 (等電點(diǎn)沉淀 ) 當(dāng)把 pH調(diào)到目的蛋白的等電點(diǎn)時，目的蛋白就會沉淀出來。這樣沉淀出來的蛋白質(zhì)保持著天然構(gòu)象，能重新溶解于具有適當(dāng) pH和一定濃度的緩沖液中。 pH和離子強(qiáng)度對 β乳球蛋白溶解度的影響 隨著離子強(qiáng)度的增加 ， 溶解度增加 。 （ 鹽溶作用 ） 在 ～ 溶解度最小 。 利用溶解度差別的純化方法 (鹽溶和鹽析 ) 鹽溶作用主要是蛋白質(zhì)
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