【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 線粒體、高等植物的葉綠體等也含有 DNA和功能基因，這些 DNA被稱(chēng)為染色體外遺傳因子。 ? （ 2） 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)練 ? 原核 DNA分子的絕大部分是用來(lái)編碼蛋白質(zhì)的，只有非常小的一部分不轉(zhuǎn)錄，而且，這些不轉(zhuǎn)錄DNA序列通常是控制基因表達(dá)的序列，如 216。Xl74的 H和 A基因之間 (3906－ 3973位核苷酸 )就包括了 RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)及核糖體結(jié)合位點(diǎn)等基因表達(dá)調(diào)控元件。 ? （ 3） 存在轉(zhuǎn)錄單元 多順?lè)醋? ? 原核生物 DNA序列中功能相關(guān)的 RNA和蛋白質(zhì)基因，往往叢集在基因組的一個(gè)或幾個(gè)特定部位，形成功能單位或轉(zhuǎn)錄單元，它們可被一起轉(zhuǎn)錄為含多個(gè) mRNA的分子，叫多順?lè)醋觤RNA。功能相關(guān)的基因。 ? 如 216。Xl74中的 DEJFGH等都串聯(lián)在一起轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一條mRNA鏈，然后再翻譯成各種蛋白質(zhì)，其中 J、 F、 G及 H編碼外殼蛋白， D蛋白與病毒裝配有關(guān)， E蛋白則導(dǎo)致細(xì)菌的裂解。這是功能相關(guān)基因協(xié)同表達(dá)的方式之一。 ?X174 DEJFGH mRNA 蛋白 J、 F、 G H D E ? （ 4） 重疊基因 ? 即同一段 DNA能攜帶兩種不同蛋白質(zhì)的信息。 ? 主要有以下幾種情況： ? (1)一個(gè)基因完全在另一個(gè)基因里面，如基因 B在基因 A內(nèi)，基因 E在基因 D內(nèi)。 ? (2)部分重疊，如基因 K和基因 C的部分重疊。 ? (3)兩個(gè)基因只有一個(gè)堿基對(duì)的重疊，如 D基因終止密碼子的最后一個(gè)堿基是 J基因起始密碼子的第一個(gè)堿基。 ● 有 重疊基因（ Sanger 發(fā)現(xiàn)） 基因內(nèi)基因 部分重疊基因 一個(gè)堿基重疊 ? 盡管這些重疊基因的 DNA序列大致相同，但由于基因重疊部位一個(gè)堿基的變化可能影響后續(xù)肽鏈的全部序列，從而編碼完全不同的蛋白質(zhì)。除了216。X174外， SV40病毒、 λ 噬菌體的 DNA中也存在基因重疊現(xiàn)象。 ? 基因重疊可能是生物進(jìn)化過(guò)程中自然選擇的結(jié)果。 二、 DNA的組成與結(jié)構(gòu) （一） DNA的結(jié)構(gòu) ? 1. DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu) : ? 就是指 4種核苷酸的連接及其排列順序，表示了該 DNA分子的化學(xué)構(gòu)成。 ? 核苷酸序列對(duì) DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成有很大影響，如 BDNA中多聚（ GC）區(qū)易出現(xiàn)左手螺旋 DNA（ ZDNA），而反向重復(fù)的 DNA片段易出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)等。 DNA不僅具有嚴(yán)格的化學(xué)組成，還具有特殊的高級(jí)結(jié)構(gòu)，它主要以有規(guī)則的 雙螺旋 形式存在，其基本特點(diǎn)是： ? （ 1） DNA分子是由兩條平行的脫氧核苷酸長(zhǎng)鏈盤(pán)繞而成的。 （ 2） DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側(cè)，構(gòu)成基本骨架，堿基排列在內(nèi)側(cè)。 （ 3）兩條鏈上的堿基通過(guò)氫鍵相結(jié)合，形成堿基對(duì)，它的組成有一定的規(guī)律。這就是嘌呤與嘧啶配對(duì)，而且腺嘌呤（ A）只能與胸腺嘧啶（ T）配對(duì)，鳥(niǎo)嘌呤（ G）只能與胞嘧啶（ C）配對(duì)。 DNA 的二級(jí)結(jié)構(gòu) 1）定義： 指 兩 條多核苷酸鏈反向平行盤(pán)繞所產(chǎn)生的雙螺旋結(jié)構(gòu) 。 ? 這些研究表明 DNA的分子結(jié)構(gòu)不是一成不變的，在不同的條件下可以有所不同。但是，這些不同構(gòu)象的 DNA都有共同的一點(diǎn) : ? 它們都是 右手雙螺旋 ； ? 兩條反向平行的核苷酸鏈通過(guò)Ｗ atsonCrick堿基配對(duì)結(jié)合在一起； ? 鏈的重復(fù)單位是單核苷酸； ? 這些螺旋中都有兩個(gè)螺旋溝，分為大溝與小溝，只是它們的寬窄和深淺程度有所不同 。 DNA結(jié)構(gòu)的多態(tài)性 A B Z ?Double helix ?B form: Righthanded 10 base pairs/turn 34 197。 /turn Diameter: ca. 20 197。 Other forms: A: 11 bases/turn, base plate 20176。 slant Z: 12 bases/turn, lefthanded helical, one groove ? AT豐富的 DNA片段常呈 BDNA。 ? 若 DNA雙鏈中一條鏈被相應(yīng)的 RNA鏈所替換，會(huì)變構(gòu)成ADNA。 ? 當(dāng) DNA處于轉(zhuǎn)錄狀態(tài)時(shí)， DNA模板鏈與由它轉(zhuǎn)錄所得的RNA鏈間形成的雙鏈就是 ADNA。 ? ADNA構(gòu)象對(duì)基因表達(dá)有重要意義。此外 BDNA雙鏈都被RNA鏈所取代而得到由兩條 RNA鏈組成的雙螺旋結(jié)構(gòu)也是 ADNA。 ? 在右手螺旋中，除 ADNA、 BDNA螺旋外，還存在 B39。DNA、CDNA和 DDNA等不同形式。 ? 左手螺旋 ZDNA ? ZDNA(英文字 Zigzag的第一個(gè)字母 )結(jié)構(gòu)是 1979年由 Rich提出的。 ? Rich用一位荷蘭科學(xué)家提供的d(CGCGCG)結(jié)晶，對(duì)它進(jìn)行 X射線衍射結(jié)構(gòu)分析，最后提出了 ZDNA結(jié)構(gòu)模型。 ? 當(dāng)時(shí)，由于用右手螺旋結(jié)構(gòu)模型解鏈過(guò)程來(lái)解釋大分子 DNA復(fù)制時(shí)遇到困難，該模型的提出曾一度動(dòng)搖過(guò)右手螺旋學(xué)說(shuō)，現(xiàn)已證明，左手螺旋 ZDNA只是右手螺旋結(jié)構(gòu)模型的一個(gè)補(bǔ)充和發(fā)展。 ? 雖然 BDNA是最常見(jiàn)的 DNA構(gòu)象，但 ADNA和 ZDNA似乎具有不同的生物活性。 在鄰近調(diào)控系統(tǒng)中，與調(diào)節(jié)區(qū)相鄰的轉(zhuǎn)錄區(qū)被 ZDNA抑制，只有當(dāng) ZDNA轉(zhuǎn)變?yōu)?BDNA后，轉(zhuǎn)錄才得以活化。 而在遠(yuǎn)距離調(diào)控系統(tǒng)中， ZDNA可通過(guò)改變負(fù)超螺旋水平，決定聚合酶能否與模板鏈相結(jié)合而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始活性。 3 DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu) ? DNA的高級(jí)結(jié)構(gòu)是指 DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲盤(pán)繞所形成的特定空間結(jié)構(gòu)。超螺旋結(jié)構(gòu)是 DNA高級(jí)結(jié)構(gòu)的主要形式，可分為正超螺旋與負(fù)超螺旋兩大類(lèi)，它們?cè)谔厥馇闆r下可以相互轉(zhuǎn)變。 線狀 DNA形成的超螺旋 環(huán)狀 DNA形成的超螺旋 拓?fù)洚悩?gòu)酶 or溴化乙錠 拓?fù)洚悩?gòu)酶 or溴化乙錠 DNA扭曲與雙螺 旋相同（擰緊） DNA扭曲與雙螺旋相反（松開(kāi)） 負(fù)超螺旋 松弛 DNA 正超螺旋 ? ? 變性 (denaturation)和復(fù)性 (renaturation) 是雙鏈核酸分子的二個(gè)重要物理特性。也是核酸研究中經(jīng)常引用的術(shù)語(yǔ)。 ? 雙鏈 DNA、 RNA雙鏈區(qū)、 DNA: RNA雜種雙鏈 (hybrid duplex)以及其它異源雙鏈核酸分子 (heteroduplex) 都具有此性質(zhì)。 ? (1)DNA的變性： ? 指 DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)松解為無(wú)規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。 ? 就是維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵和疏水鍵的斷裂。 ? 斷裂可以是部分的或全部的，是可逆的或是非可逆的。 ? DNA變性不涉及到其一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。 ? 凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素都可以成為變性的條件 : ? 加熱 ? 極端的 pH ? 有機(jī)試劑甲醇、乙醇 ? 尿素及甲酰胺等 ? 均可破壞雙螺旋結(jié)構(gòu)引起核酸分子變性。 ? 溶液粘度降低 ： ? DNA雙螺旋是緊密的 剛性 結(jié)構(gòu) ,變性后代之以“ 柔軟 ” 而松散的無(wú)規(guī)則單股線性結(jié)構(gòu)， DNA粘度因此而明顯下降。 ? 溶液旋光性發(fā)生改變 ： ? 變性后整個(gè) DNA分子的對(duì)稱(chēng)性及分子局部的構(gòu)性改變 , 使 DNA溶液的旋光性發(fā)生變化。 變性導(dǎo)致 DNA理化及生物學(xué)性質(zhì)的改變 : ? 增色效應(yīng)或高色效應(yīng) (hyperchromic effect)： ? —— 指變性后 DNA溶液的紫外吸收作用增強(qiáng)的效應(yīng)。 ? DNA分子具有吸收 250－ 280nm波長(zhǎng)的紫外光的特性，其吸收峰值在 260nm。 DNA分子中堿基間電子的相互作用是紫外吸收的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) ,但雙螺旋結(jié)構(gòu)有序堆積的堿基又 束縛 了這種作用。變性 DNA的雙鏈解開(kāi) ,堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收 ,故而產(chǎn)生增色效應(yīng)。 ? 以加熱為變性條件時(shí) ,增色效應(yīng)與溫度有十分密切的關(guān)系 ,這主要是變性溫度取決于 DNA自身的性質(zhì)。 ? 熱變性使 DNA分子雙鏈解開(kāi)所需溫度稱(chēng)為熔解溫度 ( melting temperature,Tm)。 ? Tm定義中包含了使被測(cè) DNA的 50%發(fā)生變性的意義 . ? 不同來(lái)源 DNA具有不同的 Tm。 ? 在溶劑相同的前提下 ,有下列兩方面造成的： ?(i)DNA的均一性： ? DNA分子中堿基組成的均一性：如人工合成的只含有一種堿基對(duì)的多核苷酸片段 ,與天然 DNA比較 ,其 Tm值范圍就較窄。因前者在變性時(shí)的氫鏈斷裂幾乎可 “ 齊同 ” 進(jìn)行 ,故所要求的變性溫度更趨于一致。 ? 其次還包含有待測(cè)樣品 DNA的組成是否均一：如樣品中只含有一種病毒 DNA,其 Tm值范圍較窄 , 若混雜有其它來(lái)源的 DNA,則 Tm值范圍較寬。 ? 總的說(shuō) ,DNA均一性 ,變性的 DNA鏈各部分的氫鍵斷裂所需能量較接近 ,Tm值范圍較窄 ,反之亦然。 ? (ii)DNA的 (G+C)含量： ? 在溶劑固定的前提下， Tm值的高低取決于 DNA分子中的(G+C)的含量。 (G+C)含量越高 ,即 GC堿基對(duì)越多 ,Tm值越高。 ? 因 GC堿基對(duì)具有 3對(duì)氫鍵 ,而 AT堿基對(duì)只有 2對(duì)氫鍵 ,DNA中 (G+C)含量高顯然更能增強(qiáng)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性 ,破壞 GC間氫鍵需比 AT氫鍵付出更多的能量 ,故 (G+C)含量高的 DNA,其變性 Tm也高。 ? 實(shí)驗(yàn)說(shuō)明 ,Tm與 DNA中 (G+C)含量存在著密切相關(guān)性 ,變性溫度還受到溶液離子強(qiáng)度的影響。 Tm與 (G+C)含量 (X)百分?jǐn)?shù)的這種關(guān)系可用以下經(jīng)驗(yàn)公式表示 (DNA溶于 中 ): ? X%(G+C)=() ? (2)DNA的復(fù)性： ? 指變性 DNA在適當(dāng)條件下 ,二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。 ? 它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過(guò)程。 ? 熱變性 DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性 ,此過(guò)程稱(chēng)之為 “ 退火 ” (annealing)。 ? DNA的復(fù)性受溫度和 DNA自身特性等影響。 ? 溫度和時(shí)間 ： ? 一般認(rèn)為比 Tm低 5℃ 左右的溫度是復(fù)性的最佳條件 。 ? 降溫時(shí)間太短以及溫差大均不利于復(fù)性。 ? DNA濃度 : ? 復(fù)性的速度與 DNA濃度的平方成正比。即溶液中 DNA分子越多，相互碰撞結(jié)合 “ 成核 ” 的機(jī)會(huì)越大。 ?DNA順序的復(fù)雜性 : ? 簡(jiǎn)單順序的 DNA分子 , 互補(bǔ)堿基的配對(duì)較易實(shí)現(xiàn)。 ? 而順序復(fù)雜的 DNA,如小牛 DNA的非重復(fù)部分 ,一般以單拷貝存在于基因組中 ,這種復(fù)雜特定序列要實(shí)現(xiàn)互補(bǔ) ,顯然要比上述簡(jiǎn)單序列困難得多。 ? Cot： Co為單鏈 DNA的起始濃度 ,t是以秒為單位的時(shí)間，用以表示復(fù)性速度與 DNA序列復(fù)雜性的關(guān)系。 ? 將溫度、溶劑離子強(qiáng)度、核酸片段大小不變，以不同程度的核酸分子重締合部分 (在時(shí)間 t時(shí)的復(fù)性率 )取對(duì)數(shù)后對(duì) Cot作圖 ,可以得到如圖所示的曲線 ,用非重復(fù)堿基對(duì)數(shù)表示核酸分子的復(fù)雜性。如多聚 (A)的復(fù)雜性為 1,重復(fù)的 (ATGC)n組成的多聚體的復(fù)雜性為 4,分子長(zhǎng)度是 105，核苷對(duì)的非重復(fù) DNA的復(fù)雜性為 105。原核生物基因組均為非重復(fù)順序 ,故以非重復(fù)核苷酸對(duì)表示的復(fù)雜性直接與基因組大小成正比 ,對(duì)于真核生物基因組中的非重復(fù)片段也是如此。 ? 在標(biāo)準(zhǔn)條件下 (一般為 離子濃度 ,400核苷酸的長(zhǎng)的片段 )測(cè)得的復(fù)性率達(dá) Cot值 (稱(chēng) Cot 1/2),與核苷酸對(duì)的復(fù)雜性成正比。 ? 對(duì)于原核生物核酸分子，此值可代表基因組的大小及基因組中核苷酸對(duì)的復(fù)雜程度。 ? 真核基因組中因含有許多不同程度的重復(fù)序列，所得到的 Cot曲線要較圖中的 S曲線復(fù)雜。 ? (3)核酸分子雜交： ? 分子雜交 (hybridization)是核酸研究中一項(xiàng)最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。其基本原理就是應(yīng)用核酸分子的變性和復(fù)性的性質(zhì) ,使來(lái)源不同的 DNA(或 RNA)片段 ,按堿基互補(bǔ)關(guān)