【文章內(nèi)容簡介】 線粒體、高等植物的葉綠體等也含有 DNA和功能基因，這些 DNA被稱為染色體外遺傳因子。 ? （ 2） 結構簡練 ? 原核 DNA分子的絕大部分是用來編碼蛋白質的，只有非常小的一部分不轉錄，而且，這些不轉錄DNA序列通常是控制基因表達的序列，如 216。Xl74的 H和 A基因之間 (3906－ 3973位核苷酸 )就包括了 RNA聚合酶結合位點、轉錄終止信號區(qū)及核糖體結合位點等基因表達調控元件。 ? （ 3） 存在轉錄單元 多順反子 ? 原核生物 DNA序列中功能相關的 RNA和蛋白質基因，往往叢集在基因組的一個或幾個特定部位，形成功能單位或轉錄單元，它們可被一起轉錄為含多個 mRNA的分子，叫多順反子mRNA。功能相關的基因。 ? 如 216。Xl74中的 DEJFGH等都串聯(lián)在一起轉錄產(chǎn)生一條mRNA鏈，然后再翻譯成各種蛋白質，其中 J、 F、 G及 H編碼外殼蛋白， D蛋白與病毒裝配有關， E蛋白則導致細菌的裂解。這是功能相關基因協(xié)同表達的方式之一。 ?X174 DEJFGH mRNA 蛋白 J、 F、 G H D E ? （ 4） 重疊基因 ? 即同一段 DNA能攜帶兩種不同蛋白質的信息。 ? 主要有以下幾種情況： ? (1)一個基因完全在另一個基因里面，如基因 B在基因 A內(nèi)，基因 E在基因 D內(nèi)。 ? (2)部分重疊，如基因 K和基因 C的部分重疊。 ? (3)兩個基因只有一個堿基對的重疊，如 D基因終止密碼子的最后一個堿基是 J基因起始密碼子的第一個堿基。 ● 有 重疊基因（ Sanger 發(fā)現(xiàn)） 基因內(nèi)基因 部分重疊基因 一個堿基重疊 ? 盡管這些重疊基因的 DNA序列大致相同，但由于基因重疊部位一個堿基的變化可能影響后續(xù)肽鏈的全部序列，從而編碼完全不同的蛋白質。除了216。X174外， SV40病毒、 λ 噬菌體的 DNA中也存在基因重疊現(xiàn)象。 ? 基因重疊可能是生物進化過程中自然選擇的結果。 二、 DNA的組成與結構 （一） DNA的結構 ? 1. DNA的一級結構 : ? 就是指 4種核苷酸的連接及其排列順序，表示了該 DNA分子的化學構成。 ? 核苷酸序列對 DNA高級結構的形成有很大影響，如 BDNA中多聚（ GC）區(qū)易出現(xiàn)左手螺旋 DNA（ ZDNA），而反向重復的 DNA片段易出現(xiàn)發(fā)卡式結構等。 DNA不僅具有嚴格的化學組成，還具有特殊的高級結構，它主要以有規(guī)則的 雙螺旋 形式存在，其基本特點是： ? （ 1） DNA分子是由兩條平行的脫氧核苷酸長鏈盤繞而成的。 （ 2） DNA分子中的脫氧核糖和磷酸交替連接，排在外側，構成基本骨架，堿基排列在內(nèi)側。 （ 3）兩條鏈上的堿基通過氫鍵相結合，形成堿基對，它的組成有一定的規(guī)律。這就是嘌呤與嘧啶配對，而且腺嘌呤（ A）只能與胸腺嘧啶（ T）配對，鳥嘌呤（ G）只能與胞嘧啶（ C）配對。 DNA 的二級結構 1）定義： 指 兩 條多核苷酸鏈反向平行盤繞所產(chǎn)生的雙螺旋結構 。 ? 這些研究表明 DNA的分子結構不是一成不變的，在不同的條件下可以有所不同。但是，這些不同構象的 DNA都有共同的一點 : ? 它們都是 右手雙螺旋 ； ? 兩條反向平行的核苷酸鏈通過Ｗ atsonCrick堿基配對結合在一起； ? 鏈的重復單位是單核苷酸； ? 這些螺旋中都有兩個螺旋溝，分為大溝與小溝，只是它們的寬窄和深淺程度有所不同 。 DNA結構的多態(tài)性 A B Z ?Double helix ?B form: Righthanded 10 base pairs/turn 34 197。 /turn Diameter: ca. 20 197。 Other forms: A: 11 bases/turn, base plate 20176。 slant Z: 12 bases/turn, lefthanded helical, one groove ? AT豐富的 DNA片段常呈 BDNA。 ? 若 DNA雙鏈中一條鏈被相應的 RNA鏈所替換，會變構成ADNA。 ? 當 DNA處于轉錄狀態(tài)時， DNA模板鏈與由它轉錄所得的RNA鏈間形成的雙鏈就是 ADNA。 ? ADNA構象對基因表達有重要意義。此外 BDNA雙鏈都被RNA鏈所取代而得到由兩條 RNA鏈組成的雙螺旋結構也是 ADNA。 ? 在右手螺旋中，除 ADNA、 BDNA螺旋外，還存在 B39。DNA、CDNA和 DDNA等不同形式。 ? 左手螺旋 ZDNA ? ZDNA(英文字 Zigzag的第一個字母 )結構是 1979年由 Rich提出的。 ? Rich用一位荷蘭科學家提供的d(CGCGCG)結晶，對它進行 X射線衍射結構分析，最后提出了 ZDNA結構模型。 ? 當時，由于用右手螺旋結構模型解鏈過程來解釋大分子 DNA復制時遇到困難，該模型的提出曾一度動搖過右手螺旋學說，現(xiàn)已證明，左手螺旋 ZDNA只是右手螺旋結構模型的一個補充和發(fā)展。 ? 雖然 BDNA是最常見的 DNA構象，但 ADNA和 ZDNA似乎具有不同的生物活性。 在鄰近調控系統(tǒng)中，與調節(jié)區(qū)相鄰的轉錄區(qū)被 ZDNA抑制，只有當 ZDNA轉變?yōu)?BDNA后，轉錄才得以活化。 而在遠距離調控系統(tǒng)中， ZDNA可通過改變負超螺旋水平，決定聚合酶能否與模板鏈相結合而調節(jié)轉錄起始活性。 3 DNA的高級結構 ? DNA的高級結構是指 DNA雙螺旋進一步扭曲盤繞所形成的特定空間結構。超螺旋結構是 DNA高級結構的主要形式，可分為正超螺旋與負超螺旋兩大類，它們在特殊情況下可以相互轉變。 線狀 DNA形成的超螺旋 環(huán)狀 DNA形成的超螺旋 拓撲異構酶 or溴化乙錠 拓撲異構酶 or溴化乙錠 DNA扭曲與雙螺 旋相同（擰緊） DNA扭曲與雙螺旋相反（松開） 負超螺旋 松弛 DNA 正超螺旋 ? ? 變性 (denaturation)和復性 (renaturation) 是雙鏈核酸分子的二個重要物理特性。也是核酸研究中經(jīng)常引用的術語。 ? 雙鏈 DNA、 RNA雙鏈區(qū)、 DNA: RNA雜種雙鏈 (hybrid duplex)以及其它異源雙鏈核酸分子 (heteroduplex) 都具有此性質。 ? (1)DNA的變性： ? 指 DNA分子由穩(wěn)定的雙螺旋結構松解為無規(guī)則線性結構的現(xiàn)象。 ? 就是維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵和疏水鍵的斷裂。 ? 斷裂可以是部分的或全部的，是可逆的或是非可逆的。 ? DNA變性不涉及到其一級結構的改變。 ? 凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素都可以成為變性的條件 : ? 加熱 ? 極端的 pH ? 有機試劑甲醇、乙醇 ? 尿素及甲酰胺等 ? 均可破壞雙螺旋結構引起核酸分子變性。 ? 溶液粘度降低 ： ? DNA雙螺旋是緊密的 剛性 結構 ,變性后代之以“ 柔軟 ” 而松散的無規(guī)則單股線性結構， DNA粘度因此而明顯下降。 ? 溶液旋光性發(fā)生改變 ： ? 變性后整個 DNA分子的對稱性及分子局部的構性改變 , 使 DNA溶液的旋光性發(fā)生變化。 變性導致 DNA理化及生物學性質的改變 : ? 增色效應或高色效應 (hyperchromic effect)： ? —— 指變性后 DNA溶液的紫外吸收作用增強的效應。 ? DNA分子具有吸收 250－ 280nm波長的紫外光的特性，其吸收峰值在 260nm。 DNA分子中堿基間電子的相互作用是紫外吸收的結構基礎 ,但雙螺旋結構有序堆積的堿基又 束縛 了這種作用。變性 DNA的雙鏈解開 ,堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收 ,故而產(chǎn)生增色效應。 ? 以加熱為變性條件時 ,增色效應與溫度有十分密切的關系 ,這主要是變性溫度取決于 DNA自身的性質。 ? 熱變性使 DNA分子雙鏈解開所需溫度稱為熔解溫度 ( melting temperature,Tm)。 ? Tm定義中包含了使被測 DNA的 50%發(fā)生變性的意義 . ? 不同來源 DNA具有不同的 Tm。 ? 在溶劑相同的前提下 ,有下列兩方面造成的： ?(i)DNA的均一性： ? DNA分子中堿基組成的均一性：如人工合成的只含有一種堿基對的多核苷酸片段 ,與天然 DNA比較 ,其 Tm值范圍就較窄。因前者在變性時的氫鏈斷裂幾乎可 “ 齊同 ” 進行 ,故所要求的變性溫度更趨于一致。 ? 其次還包含有待測樣品 DNA的組成是否均一：如樣品中只含有一種病毒 DNA,其 Tm值范圍較窄 , 若混雜有其它來源的 DNA,則 Tm值范圍較寬。 ? 總的說 ,DNA均一性 ,變性的 DNA鏈各部分的氫鍵斷裂所需能量較接近 ,Tm值范圍較窄 ,反之亦然。 ? (ii)DNA的 (G+C)含量： ? 在溶劑固定的前提下， Tm值的高低取決于 DNA分子中的(G+C)的含量。 (G+C)含量越高 ,即 GC堿基對越多 ,Tm值越高。 ? 因 GC堿基對具有 3對氫鍵 ,而 AT堿基對只有 2對氫鍵 ,DNA中 (G+C)含量高顯然更能增強結構的穩(wěn)定性 ,破壞 GC間氫鍵需比 AT氫鍵付出更多的能量 ,故 (G+C)含量高的 DNA,其變性 Tm也高。 ? 實驗說明 ,Tm與 DNA中 (G+C)含量存在著密切相關性 ,變性溫度還受到溶液離子強度的影響。 Tm與 (G+C)含量 (X)百分數(shù)的這種關系可用以下經(jīng)驗公式表示 (DNA溶于 中 ): ? X%(G+C)=() ? (2)DNA的復性： ? 指變性 DNA在適當條件下 ,二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現(xiàn)象。 ? 它是變性的一種逆轉過程。 ? 熱變性 DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復性 ,此過程稱之為 “ 退火 ” (annealing)。 ? DNA的復性受溫度和 DNA自身特性等影響。 ? 溫度和時間 ： ? 一般認為比 Tm低 5℃ 左右的溫度是復性的最佳條件 。 ? 降溫時間太短以及溫差大均不利于復性。 ? DNA濃度 : ? 復性的速度與 DNA濃度的平方成正比。即溶液中 DNA分子越多，相互碰撞結合 “ 成核 ” 的機會越大。 ?DNA順序的復雜性 : ? 簡單順序的 DNA分子 , 互補堿基的配對較易實現(xiàn)。 ? 而順序復雜的 DNA,如小牛 DNA的非重復部分 ,一般以單拷貝存在于基因組中 ,這種復雜特定序列要實現(xiàn)互補 ,顯然要比上述簡單序列困難得多。 ? Cot： Co為單鏈 DNA的起始濃度 ,t是以秒為單位的時間，用以表示復性速度與 DNA序列復雜性的關系。 ? 將溫度、溶劑離子強度、核酸片段大小不變，以不同程度的核酸分子重締合部分 (在時間 t時的復性率 )取對數(shù)后對 Cot作圖 ,可以得到如圖所示的曲線 ,用非重復堿基對數(shù)表示核酸分子的復雜性。如多聚 (A)的復雜性為 1,重復的 (ATGC)n組成的多聚體的復雜性為 4,分子長度是 105，核苷對的非重復 DNA的復雜性為 105。原核生物基因組均為非重復順序 ,故以非重復核苷酸對表示的復雜性直接與基因組大小成正比 ,對于真核生物基因組中的非重復片段也是如此。 ? 在標準條件下 (一般為 離子濃度 ,400核苷酸的長的片段 )測得的復性率達 Cot值 (稱 Cot 1/2),與核苷酸對的復雜性成正比。 ? 對于原核生物核酸分子，此值可代表基因組的大小及基因組中核苷酸對的復雜程度。 ? 真核基因組中因含有許多不同程度的重復序列，所得到的 Cot曲線要較圖中的 S曲線復雜。 ? (3)核酸分子雜交： ? 分子雜交 (hybridization)是核酸研究中一項最基本的實驗技術。其基本原理就是應用核酸分子的變性和復性的性質 ,使來源不同的 DNA(或 RNA)片段 ,按堿基互補關