四、基因工程的操作過(guò)程(編輯修改稿)
2025-02-13 20:20 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 變，不能合成頭部蛋白，但能合成其它外殼蛋白（尾部蛋白）。 在 cI857基因突變的 ?噬菌體的基礎(chǔ)上，選擇兩種外殼蛋白的突變型 ?噬菌體。 （ 4） 互補(bǔ)型噬菌體 外殼蛋白基因 D發(fā)生了無(wú)義突變，不能合成頭部的包裝識(shí)別蛋白，但能合成其它外殼蛋白（頭部）。 ?噬菌體 2 (5) 體外包裝過(guò)程 體外包裝好的重組噬菌體感染受體菌，使受體菌發(fā)生溶菌，形成噬菌斑。（每 ?g ?DNA能形成 106噬菌斑）。 （ 6） 轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)化率高的菌株； 有突變的菌株（與導(dǎo)入的載體基因互補(bǔ)）； 不育的菌株（不會(huì)與其他酵母接合） 。 一、導(dǎo)入酵母細(xì)胞 1. 菌株選擇 如： ura352, trp1289, leu23, leu2112, his3? 1 ?重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞 ——酵母菌、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞 （ 1）利用原生質(zhì)球進(jìn)行轉(zhuǎn)化 2. 酵母的轉(zhuǎn)化方法 酵母 原生質(zhì)體 感受態(tài) 酶去壁 CaCl PEG 插入外源基因 的酵母載體 pEG（聚乙二醇）使 細(xì)胞壁 具有通透性，允許DNA進(jìn)入。 CaCl2使 細(xì)胞膜 具有通透性，允許 DNA進(jìn)入。 轉(zhuǎn)化 酵母 插入外源基因的酵母載體 感受態(tài) 40% PEG 4000 （ 2）利用 Li+鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)化 二 導(dǎo)入植物細(xì)胞 A 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 Ti質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法 幾乎所有的雙子葉植物尤其是豆科類植物的根部常常會(huì)形成根瘤，這是由于植物根部被一種革蘭氏陰性土壤桿菌農(nóng)桿根瘤菌（ ）感染所致，其致瘤特性是由該菌細(xì)胞內(nèi)的野生型質(zhì)粒 Ti（ Tumorinducing）介導(dǎo)的。 Ti質(zhì)粒的 T－ DNA區(qū)可攜帶任何外源 DNA整合到植物基因組中。 轉(zhuǎn)化方法： 葉盤轉(zhuǎn)化法 整體植株接種轉(zhuǎn)化法 原生質(zhì)體共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化法 葉盤 消毒 切取 土壤農(nóng)桿菌浸泡 看護(hù)培養(yǎng)基 愈傷組織 分化幼苗 葉盤法（ leaf disk) 植物細(xì)胞 原生質(zhì)體 纖維素酶和果膠酶 DNA 混合入電擊緩沖液 12kV電擊 愈傷組織 幼苗 分化 1. 電擊法（ electroporation) B 直接轉(zhuǎn)移法 又稱 高速微型子彈射擊法（ Highvelocity microprojectiles)，利用高速運(yùn)行的金屬顆粒轟擊細(xì)胞時(shí)能進(jìn)入細(xì)胞的現(xiàn)象，將包在金屬顆粒表面的外源 DNA分子隨之帶入細(xì)胞內(nèi)。 DNA ?m鎢彈頭 吸附 特制手槍 射擊植物細(xì)胞 裝入 （ gene gun） CaCl PEG 直徑小、能量高的激光束可引起細(xì)胞膜可逆性穿孔。先在熒光顯微鏡下找出合適的細(xì)胞，用激光源代替熒光，發(fā)生激光束脈沖造成膜穿孔，使周圍DNA進(jìn)入細(xì)胞。 利用低音強(qiáng)脈沖超聲波的物理作用，可逆性擊穿細(xì)胞膜?？蓽p少對(duì)細(xì)胞的損傷。 用顯微注射儀，通過(guò)機(jī)械方法把外源 DNA直接注入細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核。關(guān)鍵步驟：固定細(xì)胞 多聚物如 PEG、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸和二價(jià)陽(yáng)離子（ Mg2+、 Ca2+）與 DNA混合，可在原生質(zhì)體表面形成沉淀顆粒，同時(shí)引起膜表面電荷的紊亂，干擾細(xì)胞間識(shí)別，使原生質(zhì)體內(nèi)吞噬外源 DNA. 瓊脂糖包埋法、多聚賴氨酸連結(jié)法、吸管支持法 將外源 DNA涂在授粉的枝頭上，使其沿著花粉管經(jīng)過(guò)珠心進(jìn)入尚未形成正常細(xì)胞壁的卵、合子或早期胚胎細(xì)胞中，從而實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。這一方法是我國(guó)科學(xué)家周光宇首先提出設(shè)計(jì)的，目前已應(yīng)用于水稻、小麥、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的轉(zhuǎn)基因研究。 用人工構(gòu)建的磷脂雙分子層組成的膜包裹 DNA，通過(guò)脂質(zhì)體與原生質(zhì)體的融合或原生質(zhì)體的吞噬，把外源 DNA轉(zhuǎn)至細(xì)胞內(nèi)。可與 PEG結(jié)合使用。 （ 1）原理： 三、導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞 1. 磷酸鈣沉淀法 HEPES緩沖液與含有氯化鈣－ DNA的溶液緩慢混合，會(huì)形成含磷酸鈣－ DNA的沉淀。哺乳動(dòng)物細(xì)胞能捕獲粘附在細(xì)胞表面的 磷酸鈣－ DNA沉淀物。 依據(jù)不同的細(xì)胞類型，平皿上最多能有 10%的細(xì)胞能吸收 DNA沉淀。 （ 2）操作過(guò)程 脂質(zhì)體有商業(yè)試劑盒（如 Life Technologies） 2. 脂質(zhì)體（ lipofectin）介導(dǎo)法 脂類包埋 DNA，通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。 直接把外源 DNA注射到宿主細(xì)胞核里，使其整合到染色體上。 3. 顯微注射法 (microinjection) 二乙氨乙基（ diethylaminoehtyl， DEAE）葡萄糖能促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝入外源 DNA。 4. DEAE葡萄糖傳染法 二乙氨乙基（ DE AE ）+ + + + + + + + +++++++++++++++DNA 二乙氨乙基（ DEA E ）+ + + + + + + + +++++++++++++++葡聚糖 葡聚糖 +DNA 吸附到細(xì)胞表面后被細(xì)胞吞入，部分 DNA可以進(jìn)入到細(xì)胞核里。 DEAEdextran 細(xì)胞 外源 DNA 預(yù)處理 攝入 DEAEdextran 外源 DNA 細(xì)胞 混合 DEAEdextran對(duì)細(xì)胞有毒 ! 外源基因?qū)爰?xì)胞的方法 C 重組體的篩選和鑒定 C 重組體的篩選和鑒定 ? 依賴于表型特征篩選法 ? 依賴于重組子結(jié)構(gòu)特征分析篩選法 ? 核酸分子雜交檢測(cè)法 ? 免疫化學(xué)檢測(cè)法 ? 轉(zhuǎn)譯篩選法 由于重組率和轉(zhuǎn)化率不可能達(dá)到理想極限，因此必須借助各種篩選和鑒定方法區(qū)分 轉(zhuǎn)化子 與非轉(zhuǎn)化子、 重組子 與非重組子、目的重組子 與非目的重組子。 轉(zhuǎn)化子 重組子 期望重組子 A 抗藥性標(biāo)記篩選 人工構(gòu)建的質(zhì)粒、柯斯質(zhì)粒、噬菌體質(zhì)粒都帶有抗藥性基因作為篩選標(biāo)記，正向選擇，初步篩選。如 pBR322質(zhì)粒上有兩個(gè)抗菌素抗性基因 : Tetr和 Ampr。 第一節(jié) 依賴于表型特征篩選法 一、利用載體提供的表型特征篩選 pBR322 pHC79 MCS pUC18/pUC19 ori Ampr lacZ’ lacI M13 ori pUC118/119 （ 1）四環(huán)素 抗性基因 ： （ 2）氨芐青霉素抗性基因： 1. 常用 抗性遺傳標(biāo)記 產(chǎn)生 ?內(nèi)酰胺酶，可降解環(huán)境中的 Amp，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇幔沟?青霉素指示液（ I2KIAampicillin）（藍(lán)灰色）褪色。 表達(dá)能改變細(xì)胞膜的蛋白，防止 Tet進(jìn)入細(xì)胞后干擾蛋白合成。 （ 3）氯霉素抗性基因： 表達(dá)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（ CAT），使 Cm乙?；?。 （ 4）卡那霉素抗性基因： 表達(dá)能修飾 Kan的酶，阻遏 Kan對(duì)核糖體的干擾。 2. 注意問(wèn)題
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