堿基順序的化學(xué)分析法(編輯修改稿)
2025-02-12 20:22 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 袋置于水平電泳板上用 1 TBE浸沒 恒壓 100V電泳 改變電泳方向， 30秒，使樣品脫離透析膜 取出透析袋，用新槍頭吸取透析袋中緩沖液到另一新離心管中 用 1/2體積 1 TBE洗凈透析管，并將其吸入樣品管中 用酚抽提洗脫回收樣品，然后以乙醇沉淀 通過第二次限制酶酶切及凝膠電泳分離回收末端標(biāo)記的 DNA片段 ? 第二次限制性酶酶解 將干燥的 DNA樣品溶于適量體積的雙蒸水中，溶解完畢，加入： 10 限制酶緩沖液 合適的限制性內(nèi)切酶 補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為 20 μ l，混勻后于 37 ℃ 保溫 2小時 若酶切反應(yīng)完全，像酶切反應(yīng)液中加入 5ul加樣緩沖液 非變性聚丙烯凝膠電泳分離 合成的寡核苷酸 DNA樣品的 5 ’末端標(biāo)記 ? 合成的寡核苷酸 DNA測序前應(yīng)用 T4多核苷酸激酶進(jìn)行 5 ’末端標(biāo)記。 取 100ng oligo樣品溶于 20 μ l雙蒸水中，加入：10 T4多核苷酸激酶 T4多核苷酸激酶 γ32PATP 混勻后置于 37 ℃ 保溫 30分鐘 加入 10ul加樣緩沖液以終止反應(yīng) 上樣于 20％非變性聚丙烯酰胺凝膠，以 300V電泳適當(dāng)時間 放射自顯影和洗脫 特異性的堿基化學(xué)裂解反應(yīng) ? 堿基特異性地裂解反應(yīng)包括： ① 先對特定堿基進(jìn)行化學(xué)修飾； ② 堿基的消除：是修飾的堿基從糖環(huán)上脫落。要確保每一個 DNA分子平均只有一個靶堿基被修飾。隨后用哌啶裂解修飾堿基的 5 ’和 3 ’位置。得到一組長度從一到數(shù)百個核苷酸不等的末端標(biāo)記分子，比較 G,A+G,C+T,C各個泳道，可從測序凝膠的放射自顯影片上讀出 DNA序列 ? 測序流程圖 合成的寡聚核苷酸的 M＆ G測序法 ? 合成 的 100堿基以下寡聚核苷酸的測序方法唯一不同之處在于堿基修飾反應(yīng)的時間。 G反應(yīng) 20分鐘 G+A反應(yīng)為 1小時 T+G反應(yīng)為 1小時 C反應(yīng)應(yīng)為 1小時 切割產(chǎn)物可用 20％的變性 PAGE膠進(jìn)行分離 序列膠高壓電泳及序列的閱讀 ? 核苷酸順序的閱讀 化學(xué)裂解反應(yīng)并不完全是絕對堿基特異性的，四條帶為 G， G+A， C+T， C。這些帶分別來自 G， G+A， C+T， C處斷裂的 DNA片段中心的兩條帶 G+A， C+A，含有所有標(biāo)記 DNA的降解產(chǎn)物。需要通過從 C+T泳道出現(xiàn)的條帶中扣除 C泳道的條帶而推斷 T殘基的位置，同樣的， A殘基的位置也要通過從 A+G泳道的條帶推斷出來。 讀片時應(yīng)從底部開始，越靠近標(biāo)記端斷裂的那些
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