堿基順序的化學(xué)分析法-在線瀏覽
2025-03-05 20:22本頁(yè)面
【正文】 方法一 機(jī)械性洗脫 【 碾碎 浸泡 過(guò)濾 沉淀法 】 將切下的膠塊置于 ml微量離心管中 用干凈的玻璃棒將膠塊搗碎 加入 400 μ l洗脫緩沖液 蓋好管蓋并用 parafilm膜封口 37 ℃ 震蕩至少 4小時(shí)或過(guò)夜 用硅化玻璃棉裝入一個(gè) 1ml槍頭 將洗脫液過(guò)濾到一支微量離心管中 再另加 100 μ l洗脫緩沖液到洗脫管中洗脫殘余樣品 重復(fù) 7 用手提式射線監(jiān)測(cè)器監(jiān)測(cè)過(guò)濾樣品，樣品應(yīng)大部分得以回收 1像過(guò)濾樣品中加入 ， 70 ℃ 放置 5分鐘沉淀 DNA樣品 1在 4 ℃ 以 15000r/min離心 15分鐘收集 DNA沉淀并在真空下干燥 DNA沉淀 1將沉淀重新溶于 200 μ ，加入 500 μ l無(wú)水乙醇， 70 ℃ 放置 5分鐘 1在 4 ℃ 以 15000r/min離心 15分鐘 1用 95％乙醇洗沉淀樣品一次，然后真空干燥 DNA樣品 方法二 電洗脫 小心將膠條置入一個(gè)直徑 1cm的透析袋中，鉗住一端 加 1 TBE于透析袋中，趕出氣泡 擠出多余的緩沖液，再扎緊透析袋另一端 將透析袋置于水平電泳板上用 1 TBE浸沒(méi) 恒壓 100V電泳 改變電泳方向， 30秒，使樣品脫離透析膜 取出透析袋，用新槍頭吸取透析袋中緩沖液到另一新離心管中 用 1/2體積 1 TBE洗凈透析管，并將其吸入樣品管中 用酚抽提洗脫回收樣品，然后以乙醇沉淀 通過(guò)第二次限制酶酶切及凝膠電泳分離回收末端標(biāo)記的 DNA片段 ? 第二次限制性酶酶解 將干燥的 DNA樣品溶于適量體積的雙蒸水中，溶解完畢，加入： 10 限制酶緩沖液 合適的限制性內(nèi)切酶 補(bǔ)充滅菌雙蒸水至總體積為 20 μ l，混勻后于 37 ℃ 保溫 2小時(shí) 若酶切反應(yīng)完全，像酶切反應(yīng)液中加入 5ul加樣緩沖液 取 100ng oligo樣品溶于 20 μ l雙蒸水中，加入：10 T4多核苷酸激酶 T4多核苷酸激酶 γ32PATP 混勻后置于 37 ℃ 保溫 30分鐘 加入 10ul加樣緩沖液以終止反應(yīng) 上樣于 20％非變性聚丙烯酰胺凝膠，以 300V電泳適當(dāng)時(shí)間 放射自顯影和洗脫 特異性的堿基化學(xué)裂解反應(yīng) ? 堿基特異性地裂解反應(yīng)包括： ① 先對(duì)特定堿基進(jìn)行化學(xué)修飾； ② 堿基的消除：是修飾的堿基從糖環(huán)上脫落。隨后用哌啶裂解修飾堿基的 5 ’和 3 ’位置。 G反應(yīng) 20分鐘 G+A反應(yīng)為 1小時(shí) T+G反應(yīng)為 1小時(shí) C反應(yīng)應(yīng)為 1小時(shí) 切割產(chǎn)物可用 20％的變性 PAGE膠進(jìn)行分離
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