【文章內(nèi)容簡介】 F）由美國著名的Gene Tools，LLC公司開發(fā)，是非離子型DNA類似物，其中的核糖被嗎啉代替（是以含有氮和氧的六元環(huán)代替RNA的五元核糖骨架）磷酸二酯鍵phosphoroamidate所取代，是進行反義抑制的有效方法。Zebrafish Morphoinos文庫包括上千個寡核苷酸序列，每個寡核苷酸序列都是針對目標序列的轉(zhuǎn)錄起始位點的序列互補而設計的，在目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄起始端形成穩(wěn)定的RNARNA雙鏈，通過阻礙mRNA和核糖體的結(jié)合而抑制翻譯的起始，它能減少傳統(tǒng)反義寡核苷酸非特異性的效應，快速誘導蛋白表達水平的下調(diào)。實驗證明這種結(jié)合是高度特異性的，長25個堿基的MFRNA中僅有4個堿基的錯配就可以造成抑制的目的基因翻譯能力的完全喪失。由于Morphoinos寡核苷酸具有靶基因結(jié)合的高度特異性以及極強的核苷酶抗性，因此可以長效的、特異性誘導目標基因的表達下調(diào)。Morphoinos以嗎啉環(huán)類似物為基架，這種獨特的結(jié)構特性使得Morphoinos具有以下幾個特點：，Morphoinos能更好地抵抗核酸酶的作用；，不激活RNaseH，不引起目標基因mRNA的降解；，針對premRNA剪切位點區(qū)設計的Morphoinos可影響mRNA剪切，得到不同的轉(zhuǎn)錄本，可以方便的用于目標基因結(jié)構域的突變研究；，可以滲入mRNA的二級結(jié)構，并且特異性好。根據(jù)MHC等位型特異的多肽結(jié)合基序,可以設計出與MHC分子結(jié)合的多肽,這可崐以通過體外實驗予以驗證。實驗中采用MHC分子表達缺陷的細胞(RMAS細胞)與相崐應的多肽共育一定時間后,可誘導細胞表達MHC分子,這可能是缺陷細胞表達不穩(wěn)定的MHC重鏈,β2M復合體,當與多肽結(jié)合后就形成三分子的穩(wěn)定結(jié)構,使得MHC分子在崐細胞表面表達增加。因此用合成多肽來驗證多肽的MHC結(jié)合性可以選用這一方法,它可以作為篩選多肽抗原的第一步。如果多肽不與MHC分子形成穩(wěn)定結(jié)合,則它很崐難被MHC分子從胞內(nèi)遞呈出來。預實驗表明,預測的7個多肽均能與H2Db分子結(jié)合。 合成多肽抗原性驗證的第二步,是將多肽與表達同一MHC分子的無關靶細胞共育,使多肽與靶細胞表面MHC分子結(jié)合,而后觀察特定抗原CTL細胞對多肽致敏靶細胞的殺傷活性,如果CTL能殺傷靶細胞,表明這一多肽可能被克隆CTL的TCR所識別,即為CTL所識別的抗原[2]。在實驗中把FBL3誘導的活化淋巴細胞(未經(jīng)過克隆的細胞)作為效應細胞,觀察到它們明顯地殺傷Gag3,Gag5結(jié)合的EL4,間接表明預測的7個多肽中,這二個多肽很可能是FBL3的腫瘤抗原。 用FBL3特異CTL殺傷實驗驗證多肽的抗原性仍是間接的方法。合成多肽驗證的第三步是用多肽替代FBL3作體內(nèi)免疫,觀察免疫小鼠能否建立抗FBL3的免疫反應。如果多肽確實是FBL3的抗原,用它免疫小鼠應誘發(fā)免疫反應,產(chǎn)生抗FBL3的效應。表1和表2顯示,多肽體內(nèi)免疫可誘導多肽特異的CTL產(chǎn)生,表明它的免疫原性是確實存在的。但用Gag3,Gag5體內(nèi)免疫后均不能誘導產(chǎn)生有效的抗FBL3腫瘤免疫反應,用FBL3攻擊免疫鼠與未免疫鼠的存活期并無明顯差別。表明這二個多肽有別于FBL3的腫瘤抗原。為什么FBL3CTL崐識別的多肽體內(nèi)免疫不能誘導能夠殺傷FBL3的CTL產(chǎn)生呢?難道CTL識別的多肽與誘導這一CTL的多肽間有一定的差別嗎?報道表明,一條多肽可以誘導一組不同識別格局CTL的產(chǎn)生,克隆CTL可以殺傷13個位點突變多肽致敏的靶細胞。認為CTL TCR僅識別1到2個關鍵氨基酸,并不是對多肽全序列的識別行為。因此我們認為,FBL3CTL對靶細胞結(jié)合多肽的識別很可能屬于這類情況。 T細胞表位或腫瘤抗原的預測是當前免疫學熱門課題,但尚處于初步階段。我們選用腫瘤原性較強的FBL3細胞,預測出可能表達的7個多肽,實驗證明多肽體內(nèi)免疫可以誘導多肽特異CTL的產(chǎn)生,但有意義多肽免疫后不能建立抗FBL3免疫反應,此與文獻報道相一致,提出以CTL作為檢測多肽抗原性的效應細胞具有一定的局限性。因此在深入研究中,將采用多個實驗系統(tǒng)綜合考查,同時擴大從Friend病毒基因序列預測多肽的范圍,和從FBL3細胞表面酸洗抗原混合液中尋找腫瘤抗原,此工作正在進行之中?；蛐酒夹g是指將大量（通常每平方厘米點陣密度高于400）探針分子固定于支持物上后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息。早在八十年代，Bains ，借助雜交方式進行序列測定。但基因芯片從實驗室走向工業(yè)化卻是直接得益于探針固相原位合成技術和照相平板印刷技術的有機結(jié)合以及激光共聚焦顯微技術的引入。它使得合成、固定高密度的數(shù)以萬計的探針分子切實可行，而且借助激光共聚焦顯微掃描技術使得可以對雜交信號進行實時、靈敏、準確的檢測和分析。正如電子管電路向晶體管電路和集成電路發(fā)展是所經(jīng)歷的那樣，核酸雜交技術的集成化也已經(jīng)和正在使分子生物學技術發(fā)生著一場革命?，F(xiàn)在全世界已有十多家公司專門從事基因芯片的研究和開發(fā)工作，且已有較為成型的產(chǎn)品和設備問世。主要代表為美國Affymetrix公司。該公司聚集有多位計算機、數(shù)學和分子生物學專家，其每年的研究經(jīng)費在一千萬美元以上，且已歷時六七年之久，擁有多項專例。產(chǎn)品即將或已有部分投放市場，產(chǎn)生的社會效益和經(jīng)濟效益令人瞻目。 基因芯片技術由于同時將大量探針固定于支持物上，所以可以一次性對樣品大量序列進行檢測和分析，從而解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交（Southern Blotting和Northern Blotting等）技術操作繁雜、自動化程度低、操作序列數(shù)量少、檢測效率低等不足。而且，通過設計不同的探針陣列、使用特定的分析方法可使該技術具有多種不同的應用價值，如基因表達譜測定、實變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等。材料和方法材料1．生物信息學軟件北京博奧生物有限公司的MAS系統(tǒng)，找出相關基因和信號途徑。美國國立生物技術信息中心。美國國立生物技術信息中心。谷歌搜索 。CNKI翻譯助手。方法1．Morpholino根據(jù)所要研究的斑馬魚基因序列設計特定的Morphoinos Antisense片段，將特定的Morphoinos片段溶于雙蒸水中配成3mM的儲液，置于20℃保存。以KCL溶液（），選擇116細胞周期的斑馬魚胚胎向植物極進行顯微注射。注射完畢，將胚胎置于28℃培養(yǎng)液中培養(yǎng)。2．基因芯片目前已有多種方法可以將寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。這些方法總體上有兩種，即原位合成（in situ synthesis）與合成點樣兩種。支持物有多種如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等，但需經(jīng)特殊處理。作原位合成的支持物在聚合反應前要先使其表面衍生出羥基或氨基（視所要固定的分子為核酸或寡肽而定）并與保護基建立共價連接；作點樣用的支持物為使其表面帶上正電荷以吸附帶負電荷的探針分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚賴氨酸等。原位合成法主要為光引導聚合技術（Lightdirected synthesis），它不僅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引導聚合技術是照相平板印刷技術（photolithography）與傳統(tǒng)的核酸、多肽固相合成技術相結(jié)合的產(chǎn)物。半導體技術中曾使用照相平板技術法在半導體硅片上制作微型電子線路。固相合成技術是當前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技術成熟且已實現(xiàn)自動化。二者的結(jié)合為合成高密度核酸探針及短肽陣列提供了一條快捷的途徑。 以合成寡核苷酸探針為例，該技術主要步驟為：首先使支持物羥基化，并用光敏保護基團將其保護起來。每次選取擇適當?shù)谋喂饽ぃ╩ask）使需要聚合的部位透光，其它部們不透光。這樣，光通過蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羥基解保護。因為合成所用的單體分子一端按傳統(tǒng)固相合成方法活化，另一端受光敏保護基的保護，所以發(fā)生偶聯(lián)的部位反應后仍舊帶有光敏保護基團。因此，每次通過控制蔽光膜的圖案（透光與不透光）決定哪些區(qū)域應被活化，以及所用單體的種類和反應次序就可以實現(xiàn)在待定位點合成大量預定序列寡聚體的目的。后一方法在多聚物的設計方面與前者相似，合成工作用傳統(tǒng)的DNA或多肽固相合成儀完成，只是合成后用特殊的自動化微量點樣裝置將其以比較高的密度涂布于硝酸纖維膜、尼龍膜或玻片上。支持物應事先進行特定處理。3．信息分析方法步驟如下：1）、數(shù)據(jù)準備，第一列為基因symbol、ID 或探針I(yè)D，后面可以附帶數(shù)值，通常為fold change2）、用戶登陸，目前為免費注冊使用。3）、登陸后，首先點擊按扭，新建項目4）、填寫項目相關信息，然后submit5）、進入分析列表，點擊紅色標記按扭，新建分析任務。6）、填寫分析任務信息，提交分析數(shù)據(jù)。輸入的分子類型可以是gene、mRNA、miRNA、protein等，每種類型支持多種ID，可以選擇性的輸出結(jié)果。7）、submit 后，點擊任務列表中的執(zhí)行按扭，出現(xiàn)提示，點擊確定，即開始運行。8）、結(jié)果展示，左邊為結(jié)果目錄，點擊各目錄，在右邊將顯示詳細結(jié)果，點擊右上角的excel 符號，即可保存結(jié)果。進入NCBI的官方網(wǎng)站（美國國立生物技術信息中心）。通過站內(nèi)搜索，在Gene中可以搜索到基因的功能和該基因的相關信息。在PubMed能搜索到信號途徑的過程和功能。實驗結(jié)果根據(jù)以上實驗步驟，將斑馬魚基因芯片試驗所得數(shù)據(jù)，導入北京博奧生物有限公司的MAS系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析，得到以下與斑馬魚發(fā)育相關的信號途徑及基因方面的分析結(jié)果。見下表：PathwayNameGeneApoptosisAKT2ApoptosisTP53Tolllike receptor signaling pathwayAKT2Tolllike receptor signaling pathwayFOSTolllike receptor signaling pathwayMAP3K7Tolllike receptor signaling pathwayTBK1RibosomeRPSARibosomeRPL4RibosomeRPL18ARibosomeRPL21RibosomeRPL23ARibosomeRPL27RibosomeRPL36ALRibosomeRPL37RibosomeRPS15ARibosomeRPS19RibosomeRPS24RibosomeRPS25RibosomeRPS26RibosomeRPS29RibosomeRPL35T cell receptor signaling pathwayAKT2T cell receptor signaling pathwayCDC42T cell receptor signaling pathwayFOST cell receptor signaling pathwayNRAST cell receptor signaling pathwayMAP3K7Synthesis and degradation of ketone bodiesACAT1Fatty acid elongation in mitochondriaHADHAFatty acid elongation in mitochondriaHADHBChronic myeloid leukemiaACVR1BChronic myeloid leukemiaAKT2Chronic myeloid leukemiaCRKChronic myeloid leukemiaCTBP2Chronic myeloid leukemiaHDAC1Chronic myeloid leukemiaNRASChronic myeloid leukemiaTP53Fc epsilon RI signaling pathwayAKT2Fc epsilon RI signaling pathwayNRASFc epsilon RI signaling pathwayRAC2Fc epsilon RI signaling pathwayRAC3Small cell lung cancerAKT2Small cell lung cancerCDK2Small cell lung cancerLAMB1Small cell lung cancerMAXSmall cell lung cancerTP53Small cell lung cancerPIAS1Ubiquitin mediated proteolysisCDC27Ubiquitin mediated proteolysisSKP1Ubiquitin mediated proteolysisPIAS1Ubiquitin mediated proteolysisCDC23Ubiquitin mediated proteolysisKEAP1Ubiquitin mediated proteolysisUBE2E3Ubiquitin mediated proteolysisCDC26Regulation of autophagyINSProteasomePSMA5ProteasomePSMB2ProteasomePSMB3ProteasomePSMD2ProteasomePSMD3ProteasomePSMD7ProteasomePSME2ProteasomeSHFM1MelanogenesisCREB1MelanogenesisCTNNB1MelanogenesisGNAI2Melanogenesis