【文章內(nèi)容簡介】 件進行回歸分析確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組成成分。利用單因素試驗對啤酒酵母Y14生產(chǎn)GSH發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定搖瓶發(fā)酵溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速及裝液量的最優(yōu)值。將上述最佳試驗條件運用到10L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)GSH的擴大重復(fù)試驗當(dāng)中，以確定最有利于工業(yè)生產(chǎn)的試驗方案。以GSH吸附率、GSH回收率、蛋白質(zhì)去除率、濃縮倍數(shù)、純化倍數(shù)為主要指標(biāo)，研究確定大孔樹脂D001分離GSH的最適上樣濃度、上樣pH、上樣流速、洗雜質(zhì)用液種類、洗脫液種類與濃度及洗脫流速。后采用Sephadex G10凝膠雙柱精制GSH，研究最適的脫鹽上樣體積與濃度，分級分離上樣體積，達(dá)到較理想的GSH純化效果。 常用研究指標(biāo)的說明為了避免重復(fù)，在此對本論文所用到的各項研究指標(biāo)進行簡要說明。菌體胞內(nèi)GSH的含量：表示每克干菌體胞內(nèi)GSH的含量，簡稱GSH含量，單位為mg/g；GSH的產(chǎn)量：表示每升發(fā)酵液中總干菌體胞內(nèi)GSH的含量，簡稱GSH產(chǎn)量，單位為mg/L；生物量：表示每升發(fā)酵液中菌體烘干后的重量，單位為g/L。GSH產(chǎn)量（mg/L）=GSH含量（mg/g） 生物量（g/L）第2章 啤酒酵母Y14發(fā)酵GSH培養(yǎng)基的優(yōu)化生產(chǎn)GSH的酵母大都是工業(yè)常用菌株，這些菌株能在寬松的培養(yǎng)條件下生長并積累GSH，但產(chǎn)量往往很低。在實際的發(fā)酵生產(chǎn)中，選育性能優(yōu)良的菌種僅僅是一個開始，還需要對發(fā)酵過程進行優(yōu)化控制，最大限度地發(fā)揮其生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的能力。要想進一步提高菌株的生物量和胞內(nèi)合成GSH能力，必須對培養(yǎng)基中各種營養(yǎng)成分進行優(yōu)化，確定適合菌株生長最適培養(yǎng)基。一些試驗設(shè)計(如正交試驗設(shè)計、因次分析設(shè)計、中心復(fù)合試驗設(shè)計等)及數(shù)據(jù)處理方法(如PlackettBurman試驗設(shè)計、響應(yīng)面分析、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型)的應(yīng)用可以減少工作量并且使試驗結(jié)果具有更高的可信度和實際應(yīng)用價值。Udeh和Achremowics考察了培養(yǎng)基中的主要成分(葡萄糖、蛋白胨、KH2PO生物素和半胱氨酸) S8H細(xì)胞形成和胞內(nèi)GSH含量的影響，采用中心復(fù)合試驗設(shè)計(Central Composition Experimental Design)方法對發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，%，與優(yōu)化前的情況相比提高近一倍[47]。李寅[48]等采用正交試驗獲得的試驗數(shù)據(jù)，通過網(wǎng)絡(luò)模型(Neural Network Model)進行分析預(yù)測， WSH 02～08發(fā)酵生產(chǎn)GSH的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，%，GSH產(chǎn)量和細(xì)胞干重也有大幅度的提高。本章以啤酒酵母Y14獲得GSH的產(chǎn)量為指標(biāo)，采用PlackettBurman設(shè)計對影響GSH生產(chǎn)的14個營養(yǎng)因素進行考察，再用BoxBehnken 設(shè)計對培養(yǎng)基成分進一步優(yōu)化，對所得的實驗數(shù)據(jù)與響應(yīng)面模型進行擬合，利用SAS(version9. 0, SAS Institute Ine , Cary , NC ,USA) 處理分析，確定最后的優(yōu)化結(jié)果。 材料 菌種：啤酒酵母Y14，由XXXX大學(xué)工業(yè)微生物湖北省重點實驗室再生資源微生物轉(zhuǎn)化研究室提供。 培養(yǎng)基： 斜面培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖 20，蛋白胨 20，酵母膏 5，瓊脂20。 種子培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖 20，蛋白胨 20，酵母膏 5。 原始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)葡萄糖 20，酵母膏5，(NH4)2SO4 ，KH2PO4 3 ，MgSO4 ，水1000mL。 主要試劑葡萄糖AR廣州化學(xué)試劑廠蛋白胨BR國藥集團化學(xué)試劑有限公司牛肉浸膏BR上海長陽生化制藥廠(NH4)2SO4AR北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司MgSO47H2OAR金山縣興塔化工廠KH2PO4AR湖州化學(xué)試劑廠DTNBARSigma，武漢新銳生物有限公司分裝98%GSHARSigma，武漢新銳生物有限公司分裝 主要儀器GW722型可見分光光度計上海精密儀器有限公司3032電熱培養(yǎng)箱上海崇明實驗儀器廠HS80A恒溫?fù)u床中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠320S pH計梅特勒托利多(上海)有限公司電子分析天平奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司15W紫外燈順德市展達(dá)電器廠CS1012電熱鼓風(fēng)干燥箱中華人民共和國重慶試驗儀器設(shè)備廠珍珠牌凈化工作臺中華人民共和國蚌埠汽化設(shè)備廠 方法 菌株活化從保藏斜面中取一環(huán)菌種劃線于新鮮斜面培養(yǎng)基上，置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 種子搖瓶培養(yǎng) 用接種環(huán)取一滿環(huán)已活化的菌種于種子培養(yǎng)基中，在溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，搖瓶裝量50mL/250mL條件下培養(yǎng)18h。 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)用無菌的5mL移液管按10%的接種量吸取種子液3mL，接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為30℃，搖床轉(zhuǎn)速150rpm，搖瓶裝量30mL/300mL條件下發(fā)酵48h。 菌種的保藏菌種接于斜面培養(yǎng)基上4℃冰箱保藏。 DTNB法檢測GSH含量[49]取樣液2mL，，反應(yīng)數(shù)分鐘后顯色穩(wěn)定后于412nm處用分光光度計測定OD值。 試驗設(shè)計方法1) PlackettBurman 設(shè)計[50] 對影響GSH生產(chǎn)的14個營養(yǎng)因素進行考察,每個因素取2個水平，各因素及其水平見表1，試驗設(shè)計見表2，表2中每行代表1個試驗，每列代表1個獨立的變量，符號“ + ”和“”分別代表高和低2個不同的水平。2) BoxBehnken 設(shè)計對培養(yǎng)基成分的進一步優(yōu)化[51]　對PlackettBurman設(shè)計試驗篩選出的有較大影響因素，利用BoxBehnken設(shè)計對培養(yǎng)基進一步的優(yōu)化。每個因素取3個水平，在中心點上有3個重復(fù)。試驗數(shù)據(jù)經(jīng)多項式回歸分析得到一個關(guān)于響應(yīng)值與自變量關(guān)系的二階模型，該方程即為描述響應(yīng)量(應(yīng)變量)和自變量(操作條件)關(guān)系的經(jīng)驗?zāi)Ｐ汀?) 對優(yōu)化試驗所得的實驗數(shù)據(jù)與響應(yīng)面模型進行擬合，便可以得到模型中的各個系數(shù)。再對該多元函數(shù)進行分析便可確定出其極值點以及取得極值的相應(yīng)的自變量的取值。最后按照計算所得到的參數(shù)進行試驗驗證模型的可靠性，確定最后的優(yōu)化結(jié)果。試驗數(shù)據(jù)均用SAS (version9. 0 , SAS Institute Ine , Cary , NC ,USA) 處理分析。 結(jié)果與分析 顯著影響因素的篩選結(jié)果根據(jù)啤酒酵母生長所需營養(yǎng)要素并結(jié)合相關(guān)的文獻(xiàn)報道，試驗選取的影響因素(變量)共14個，AN編碼了14個因素，標(biāo)號為116，每行代表1個試驗，按照設(shè)計的培養(yǎng)基進行發(fā)酵試驗，每組重復(fù)3次。 PlackettBurman試驗因素與水平 The factors and levels of variables used in the PlackettBurman design試驗因素代碼 ()低水平（g/L）(+)高水平（g/L）酵母膏X139蔗糖X2010蛋白胨X3010K2H PO4X426酪蛋白X5010葡萄糖X6010MgSO4X7麥芽糖X8010NaClX926(NH4) 2SO4X10412乳糖X11010可溶性淀粉X12010Cacl2X1303尿素X14010 PlackettBurman試驗設(shè)計和結(jié)果 Experimental design and results of PlackettBurman X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14Y**1111111111111112111111111111113111111111111114111111111111115111111111111116111111111111117111111111111118111111111111119111111111111111011111111111111111111111111111112111111111111111311111111111111141111111111111115111111111111111611111111111111注：Y**表示GSH產(chǎn)量，單位為mg/L。 PlackettBurman 設(shè)計試驗的的回歸系數(shù)及其顯著性檢驗Tab Regression coefficients and their significance test of PlackettBurman design EffectEstimateStd Errort RatioP ValueX1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14利用SAS軟件對PlackettBurman試驗結(jié)果進行方差分析，Pr F值( P值)的大小表明模型及各個考察因素的顯著水平。Pr ，Pr 。其中X1，X6，X10是有意義的模型參數(shù)，因為Pr 。所以對應(yīng)的因素葡萄糖，酵母膏和(NH4)2SO4對GSH的產(chǎn)量具有顯著性的影響，而其它的因素顯著性較小。 BoxBehnken設(shè)計進一步優(yōu)化培養(yǎng)基試驗結(jié)果以主要影響GSH產(chǎn)量的葡萄糖、酵母膏和(NH4) 2SO4的濃度(g/L)為自變量。 BoxBehnken試驗因素與水平 The factors and levels of variables used in BoxBehnken design試驗因素代碼編碼水平/(g/L)10+1葡萄糖X1102030酵母膏X251015(NH4) 2SO4X34810 BoxBehnken試驗設(shè)計和試驗結(jié)果 Experimental design and results of BoxBehnken 試驗編號X1X2X3Y**111021103110411050116011701180119101101011110112101130001400015000采用國際權(quán)威的SAS軟件回歸擬合表試驗數(shù)據(jù)，可以得到二階經(jīng)驗?zāi)Ｐ蜑閅=+X1+X1X1X2X3X3式中，Y代表GSH產(chǎn)量，XXX3分別代表培養(yǎng)基中葡萄糖、酵母膏和(NH4) 2SO4的濃度(g/L)。通過SAS軟件進行方差分析來驗證回歸模型及各參數(shù)的顯著度，模型Pr ，表明該模型是高度顯著的。經(jīng)F檢驗，模型中的參數(shù)X1，X2，X1X1，X2X2，X3X3 都是顯著的(Pr )。同時，%，大于90%，% ，能對試驗數(shù)據(jù)進行較好的擬和，說明模型相關(guān)度很好。變異系數(shù)(CV)反映模型的置信度，CV 值越低模型的置信度越高,%，說明模型方程能夠很好地反映真實的試驗值。 回歸方程的方差分析 Variance analysis of the regression equation方差來源自由度平方和均方F值Pr FX11X21X31X1X11X1X21X1X31X2X21X2X31X3X31Model9一次項3二次項3交叉項3殘差項5失擬項3誤差2和14Rsquare%