【文章內(nèi)容簡介】 材應(yīng)經(jīng)過生藥學(xué)鑒定（品種、產(chǎn)地）；中藥制劑的處方、劑型、制備工藝及藥品質(zhì)量應(yīng)基本穩(wěn)定；與臨床用藥制劑相同；根據(jù)受試藥物特點(diǎn)和試驗(yàn)方法，藥效試驗(yàn)可選用不含賦形劑的中藥制劑或提取物。一般要求兩種給藥途徑，并設(shè)兩個(gè)以上劑量組，靜脈注射給藥及離體試驗(yàn)宜用水溶性高，不含干擾雜質(zhì)（如無機(jī)離子），PH值接近中性的藥液。粗制劑水溶性差者，可僅用口服給藥。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用具有動(dòng)物飼養(yǎng)合格證的動(dòng)物。對(duì)其品系、性別、年齡、體重、雌雄、健康狀態(tài)、飼養(yǎng)條件及動(dòng)物來源等應(yīng)有記錄。如：大鼠Wistar品系，雌雄不拘，2~3月齡，150g~180g。小鼠，昆明種，抗炎實(shí)驗(yàn)用雄性。還應(yīng)注意：1）根據(jù)所研究試品的藥理作用，選用與人的疾病特點(diǎn)和機(jī)能反應(yīng)近似的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。如降壓藥研究，宜選用貓、狗、大鼠，不宜使用家兔，因家兔血壓不穩(wěn)定，對(duì)某些藥物不敏感；過敏性哮喘藥研究，宜選用豚鼠；子宮平滑肌研究，宜選用家兔等；催吐實(shí)驗(yàn)宜選用犬、貓、鴿子，不宜選用家兔或鼠類，因?yàn)楹笳邿o嘔吐反應(yīng)。2）選用遺傳背景明確、模型和指標(biāo)顯著且穩(wěn)定，解剖生理特點(diǎn)符合試驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物。還應(yīng)考慮動(dòng)物是否易得、是否經(jīng)濟(jì)、是否容易飼養(yǎng)管理。如抗AS藥研究，選用鵪鶉、鴿子、家兔，經(jīng)造模后脂質(zhì)斑塊易于形成，以鵪鶉優(yōu)于家兔，其易于飼養(yǎng)，經(jīng)濟(jì)（2元/只），用藥量小（造模用膽固醇消耗量少）。給藥劑量與途徑各試驗(yàn)至少設(shè)兩個(gè)劑量組，一般應(yīng)設(shè)三個(gè)劑量組，因量效關(guān)系起碼要三個(gè)劑量組才能顯示出來，其中一個(gè)劑量應(yīng)相當(dāng)于臨床劑量（一般按公斤體重計(jì)算）的2~5倍。小鼠可10~15倍。給藥途徑一般采用二種，其中一種應(yīng)與臨床相同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的處理和分析計(jì)數(shù)資料（質(zhì)反應(yīng)指標(biāo)，是以“有”或“無”的方式出現(xiàn)，如死亡、睡眠、惇厥等）：常采用x2檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性測定。計(jì)量資料（量反應(yīng)指標(biāo)，可以數(shù)量表示藥理反應(yīng)，如血壓、心率、尿量、體溫等）：常用t檢驗(yàn)方法，如實(shí)驗(yàn)組數(shù)多也可采用F檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，最好以圖表形式表達(dá)，圖或表的內(nèi)容通常包括組別，每組動(dòng)物數(shù)，給藥劑量及所測指標(biāo)的平均值與標(biāo)準(zhǔn)差（），顯著性測定結(jié)果（P值）。（二）一般藥理研究指主要藥效以外的廣泛藥理作用研究。一、二類新藥申報(bào)有此要求。主要觀察三個(gè)方面：神經(jīng)系統(tǒng)：觀察給藥后的行為變化及活動(dòng)情況心血管系統(tǒng)：觀察給藥后的對(duì)心電圖及血壓等的影響。呼吸系統(tǒng)：觀察給藥后的對(duì)呼吸頻率、節(jié)律及深度的影響。（三）藥代動(dòng)力學(xué)研究研究新藥在體內(nèi)吸收、分布及排泄。中藥材中提取的單一化學(xué)成分可測定有關(guān)參數(shù)。三、中藥新藥毒理學(xué)研究的基本內(nèi)容中藥毒理學(xué)研究是預(yù)測中藥安全性的重要手段，通過毒性研究可以了解中藥毒性反應(yīng)的性質(zhì)、毒性程度、毒害發(fā)展過程及毒性作用是否可逆，從而在臨床試驗(yàn)時(shí)注意和采取預(yù)防措施，避免產(chǎn)生毒副作用，確保安全用藥。這是新藥審批不可缺少的環(huán)節(jié)。毒理學(xué)研究基本項(xiàng)目通常分為：急性毒性試驗(yàn)，長期毒性試驗(yàn)和特殊毒性試驗(yàn)。以前兩種為常用。（一）急性毒性試驗(yàn)?zāi)康?）估測試品毒性強(qiáng)度：常用動(dòng)物的致死量表示。根據(jù)量效曲線的斜率最大，劑量稍有變化，死亡率變化較大，此點(diǎn)反應(yīng)靈敏、準(zhǔn)確、嚴(yán)重性好，因此常以動(dòng)物半數(shù)致死量LD50作為衡量毒性程度的主要指標(biāo)。藥物的LD50愈小，說明毒性越大。2）觀察試品的毒性癥狀：記錄并了解試品對(duì)器官組織損傷部位、損傷程度，反應(yīng)出現(xiàn)時(shí)間，持續(xù)時(shí)間和恢復(fù)時(shí)間以及死亡時(shí)間。3）計(jì)算治療指數(shù)：治療指數(shù)（Therapeutic index，簡稱TI），等于LD50/ED50。TI可提供新藥粗略的安全范圍。應(yīng)注意L幫ED50的測定需在同種動(dòng)物身上，觀察同一試品，采用同一給藥途徑，在相同試驗(yàn)條件下進(jìn)行。4）為藥效學(xué)及長期毒性試驗(yàn)選擇劑量提供參考：藥效學(xué)劑量可選擇在 1/8~ 1/10LD50之間，在沒有任何參考資料的情況下，長毒劑量在1/3~1/15 LD50之間。半數(shù)致死量（LD50）的測定1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：多用小鼠6~8周齡，體重18~22g，雌雄各半，正規(guī)動(dòng)物室飼養(yǎng)的健康合格小鼠。2）給藥方法：采用兩種以上途徑，其中包括推薦臨床用藥的給藥途徑。常采用灌胃和注射給藥。如中藥制劑水溶性好的。應(yīng)測定靜注的LD50，水溶性差，無法通過注射途徑（皮下、腹腔或靜脈）給藥時(shí)，可處考慮只用胃腸道給藥。給藥容積：；。3）觀察時(shí)間：各中藥毒性反應(yīng)出現(xiàn)快、慢不同，如果代謝產(chǎn)物中毒，毒性反應(yīng)可能出現(xiàn)晚些，所以急毒觀察時(shí)間不少于7d，如遇遲發(fā)性或進(jìn)行性反應(yīng)時(shí)，還要適當(dāng)延長至14 d。4）觀察指標(biāo)：給藥后觀察反應(yīng)情況，記錄死亡時(shí)間、死亡前癥狀，各組動(dòng)物的死亡數(shù)。死亡動(dòng)物應(yīng)及時(shí)進(jìn)行尸檢，發(fā)現(xiàn)病復(fù)器官應(yīng)做病理組織學(xué)檢查。5）環(huán)境條件的控制：室溫過涼、過熱都會(huì)影響藥物吸收，從而影響藥物的毒性反應(yīng)。宜控制在20℃上下。動(dòng)物的食量不僅影響體重，也影響毒性反應(yīng)，要求給藥前禁食24h，以保證饑飽一致。6）測定方法：如Bliss法、簡化機(jī)率單位法、孫氏綜合法（改良冠氏法）等。申報(bào)新藥推薦Bliss法。不同方法各有特點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不完全相同，但方法上大同小異：首先通過預(yù)試找出全死、全不死的劑量，正式試驗(yàn)時(shí)在全死和全不死劑量中間插入2~5個(gè)劑量組，每組動(dòng)物（小鼠）至少10只，♂♀各半，各劑量按等比級(jí)數(shù)遞增（或遞減），各劑量組和死亡率之間應(yīng)呈較好的線性關(guān)系。LD50及其可信限的計(jì)算可參見實(shí)驗(yàn)教材。實(shí)驗(yàn)報(bào)告需注明日期，動(dòng)物品系、規(guī)格、數(shù)量、受試物來源及含量、各組動(dòng)物死亡率，動(dòng)物中毒表現(xiàn)及致死癥狀等。實(shí)驗(yàn)報(bào)告需注明日期，動(dòng)物品種、規(guī)格、數(shù)量、受試物來源及含量，各且動(dòng)物死亡率，動(dòng)物中毒表現(xiàn)及致死癥狀等。最大給藥量（MTD）測定多數(shù)中藥毒性較低，口服給藥吸收有限，即使一次給予最大濃度、最大容積（）也難以觀察到死亡反應(yīng)，即測不出LD50，可以測定其MTD，以反映受試品的毒性情況。方法：采用擬推薦的臨床給藥途徑，最大濃度，最大容積，一般擬一日內(nèi)2~3次給予動(dòng)物。小鼠不少于20只，♂♀各半，連續(xù)觀察7d。以不引起死亡的最大累計(jì)劑量作為最大耐受量（含生藥量g/kg表示），推算相當(dāng)于臨床用量的倍數(shù)。測定MTD量，同樣也應(yīng)嚴(yán)密觀察動(dòng)物毒性反應(yīng)，要求與LD50測定時(shí)的毒性反應(yīng)觀察相同。（二）長期毒性試驗(yàn)如果試品通過藥效學(xué)和LD50測定后，表明其有實(shí)用價(jià)值（有效，短期使用安全），可作長期毒性試驗(yàn)。長期毒性試驗(yàn)?zāi)康?）觀察動(dòng)物因連續(xù)用藥所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)，中毒開始時(shí)間及中毒時(shí)首先出現(xiàn)的癥狀。2）確定試品產(chǎn)生主要毒副作用的靶器官，明確毒副作用敏感的指標(biāo)，供臨床應(yīng)用時(shí)監(jiān)測。3）觀察停藥后組織功能損害的發(fā)展和恢復(fù)情況（可逆性觀察）。4）確定、無毒性反應(yīng)的安全劑量，即無不良反應(yīng)的最大劑量，為擬定人用安全劑量提供參考。長期毒性試驗(yàn)的要求1）動(dòng)物：至少兩種動(dòng)物（包括嚙齒類和非嚙齒類）。嚙齒類常用大鼠，6周齡，體重100g左右，動(dòng)物體重差別應(yīng)控制在平均體重20%范圍內(nèi)，每組不少于20只，♂♀各半，如試驗(yàn)周期多于90day，每組增加至♂♀各20只（40只），試驗(yàn)前至少觀察一周，記錄食量和體重等。非嚙齒類常用狗，4~6個(gè)月齡，每組至少4只，♂♀各半。2）劑量：一般設(shè)三個(gè)劑量組。高劑量組應(yīng)產(chǎn)生明顯的毒性反應(yīng)或個(gè)別動(dòng)物死亡，即接近最小致死量；低劑量組應(yīng)略高于動(dòng)物的有效量或臨床試用量而不出現(xiàn)任何觀察指標(biāo)的異常；中劑量組介于兩者之間，應(yīng)產(chǎn)生輕微毒性反應(yīng)。各劑量差以等片級(jí)數(shù)3~5倍，對(duì)照組用常水或溶媒。如試品毒性很低，測不出LD50，只設(shè)高低兩劑量組，高劑量組一般為擬用于臨床劑量的50倍以上，并應(yīng)高于藥效學(xué)試驗(yàn)之高劑量和臨床治療量。3）給藥途徑和方法：選擇與推薦臨床試驗(yàn)的給藥途徑相同?？诜幉捎霉辔阜?。給藥期長于90day者，可把藥品摻入水瓶中的飼料中，但摻入藥量不得超過動(dòng)物每日進(jìn)食量的10%，以免影響動(dòng)物的正常營養(yǎng)，而干擾毒性反應(yīng)的判斷，同時(shí)應(yīng)保證攝入藥量準(zhǔn)確。4）試驗(yàn)周期：一般為臨床用藥用期的2~3倍。但三、四類中藥制劑，處方中無毒性藥材，無配伍禁忌，又未經(jīng)化學(xué)處理，難以測出LD50，給藥劑量大于200g/kg，臨床用藥期1~3d者，可免做長期毒性試驗(yàn)。如大鼠長毒無明顯毒性，可免做狗的長毒。5）觀察指標(biāo)①一般體征、體重、外觀、行為、進(jìn)食量、糞便等。②血液學(xué)檢查：RBC、Hb、WBC及其分類，BPC、凝血 ③血液生化檢查：天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶ALT、堿性磷酸酶ALP、尿素氮BuN、總蛋白TP、白蛋白ALB、血糖GLu、總膽紅素TBIL、肌酐Gma、總膽因醇TCHO。④系統(tǒng)尸檢和病理組織學(xué)檢查：由眼觀察異常的器官應(yīng)重點(diǎn)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。臟器系數(shù)（心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、甲狀腺、睪丸、子宮、卵巢、前列腺、腦）。高劑量組發(fā)現(xiàn)有異常病變時(shí)進(jìn)行病理組織學(xué)檢查（上述臟器及胃、胸腺和可能的靶器官）。⑤狗要做心電圖。第四節(jié) 中藥藥理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一、中藥藥理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的重要性 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是很重要的，中藥藥理研究首要的問題，就是對(duì)實(shí)驗(yàn)研究的科學(xué)、合理、周密設(shè)計(jì)，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是實(shí)驗(yàn)過程的依據(jù)，是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理的前提，也是提高實(shí)驗(yàn)研究質(zhì)量的一個(gè)重要保證。嚴(yán)密而合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，不但可對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和誤差有比較準(zhǔn)確的估計(jì)，最大限度地獲得豐富而可靠的資料，而且還可減少人力，節(jié)省物力和時(shí)間，提高工作效率，避免因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)不當(dāng)，造成人力、物力的浪費(fèi)，甚至全功盡棄的不良結(jié)果。因此，實(shí)驗(yàn)研究設(shè)計(jì)，從中藥藥理實(shí)驗(yàn)研究過程來看，具有非常重要的意義。 二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的原則為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性、正確性、減少誤差和偏因。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)要注意重復(fù)，隨機(jī)和對(duì)照“三個(gè)基本原則”。1）重復(fù)：一般說來，實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)越多，結(jié)論越正確、越可靠。但重復(fù)次數(shù)越多，所消耗人力物力越大。如何用最少的動(dòng)物、實(shí)驗(yàn)次數(shù)得到可以信賴的結(jié)果。這是藥理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)必須要考慮的問題，這應(yīng)按統(tǒng)計(jì)學(xué)的要求進(jìn)行。每組該用多少動(dòng)物才能取得可信的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這要根據(jù)觀察指標(biāo)的性質(zhì)（包括藥物作用的顯著性和結(jié)果的離散度等）和動(dòng)物種類而定。如計(jì)量研究（以反應(yīng)量作為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)）所用動(dòng)物：小鼠或大鼠每組應(yīng)不少于10只，豚鼠或家兔每組不少于6只，貓或犬每組不少于4~5只。計(jì)數(shù)研究（以反應(yīng)有、無作為指標(biāo)）所用小鼠或大鼠每組應(yīng)不少于20~30只。還應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)操作的難易：復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)，即使計(jì)量實(shí)驗(yàn)用大鼠，5~6只也可以。重復(fù)次數(shù)要根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和性質(zhì)，主要藥效，指標(biāo)穩(wěn)定者，重復(fù)2~3次即可。2）隨機(jī)：中藥藥理實(shí)驗(yàn)對(duì)象為生物樣本，個(gè)體差異較大，動(dòng)物分組必須按隨機(jī)原則處理。使每一個(gè)體在實(shí)驗(yàn)中都有同等的機(jī)會(huì)，以減少主觀因素的影響或避免偏性誤差。常用的隨機(jī)方法有：①按隨機(jī)數(shù)字表分組法；②分層分組法：小鼠常采用此法。在稱重同時(shí)，將體重不同的小鼠分放于不同鼠盒中，相同體重小鼠放在一起；分組時(shí)再將相同體重的小鼠分放于不同的鼠盒中，使每只小鼠均有同等機(jī)會(huì)分配到各組中去。按此分組的結(jié)果，各實(shí)驗(yàn)組小鼠平均體重基本相同。3）對(duì)照：比較研究是科學(xué)實(shí)驗(yàn)不可缺少的條件，沒有比較就沒有區(qū)別，也就談不上科學(xué)性。所以藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)必須設(shè)立適當(dāng)?shù)膶?duì)照組。常用對(duì)照組有三種。①正常對(duì)照組：即空白對(duì)照組，不加任何處理的正常條件下進(jìn)行觀察的對(duì)照。但試驗(yàn)操作與給藥組相同，如灌胃給藥生在空白對(duì)照只給NS（或溶劑），以抵消一些非實(shí)驗(yàn)因素（給藥，捉拿等）的干擾。如實(shí)驗(yàn)需手術(shù)者還需設(shè)立假手術(shù)組。②模型對(duì)照組：不用被試品，其他處理與給藥組相同，即經(jīng)受同樣的造模處理。③陽性對(duì)照組：所用藥物是已知藥效確切、藥典收載、部頒標(biāo)準(zhǔn)或正式批準(zhǔn)生產(chǎn)的（市場化）同類中藥的西藥。所謂同類，即選用的藥物力求與被研究的新藥主治相同、功效相似，且劑型及給藥途徑均相同者。所用劑量參照被研究新藥臨床等倍量，如被研制新藥中劑量組相當(dāng)于臨床量15倍時(shí)，陽性藥也可采用15倍臨床量給予。陽性對(duì)照目的有兩個(gè)：其一是檢查方法的可靠性；其二是對(duì)此同類新藥之優(yōu)劣及特點(diǎn)。如：研究某一中藥降血糖作用，觀察對(duì)四氧嘧啶致糖尿病小鼠的降糖作用，可設(shè)立空白對(duì)照組：灌胃NS；模型對(duì)照組：靜注四氧嘧啶；陽性對(duì)照組：灌胃消渴丸，同時(shí)靜注四氧嘧啶；給藥組：灌胃被試中藥，同時(shí)靜注四氧嘧啶。各給藥組所測得血糖值比較：模型組與空白組比較，以分析模型是否成功；陽性對(duì)照組與模型組比較，以分析本方法是否可靠；給藥組與模型組比較，以分析是否有藥理作用；與陽性對(duì)照組比較，以分析兩者作用強(qiáng)度如何。在同次實(shí)驗(yàn)中給藥組與對(duì)照組做到“五同”：同時(shí)間、同地點(diǎn)、同批動(dòng)物、同等數(shù)量與同等條件三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的內(nèi)容明確研究目的和意義：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，首先應(yīng)考慮研究目的和意義，根據(jù)研究的中心問題，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)內(nèi)容設(shè)計(jì)，做到心中有數(shù)，有的放失。確定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間除了處理不同，其他條件均應(yīng)等同。保持實(shí)驗(yàn)可比性的原則。在新藥審批辦法中規(guī)定，新藥的主要藥效作用各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均應(yīng)有空白對(duì)照和已知藥物對(duì)照。藥理試驗(yàn)結(jié)果需經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。確定實(shí)驗(yàn)方法、項(xiàng)目和指標(biāo)：要有明確的規(guī)定和說明，要注意選擇能反映被研究問題的本質(zhì)的關(guān)鍵指標(biāo)。藥理作用及其機(jī)理能用客觀方法定性地加以測量，取得準(zhǔn)確可靠的數(shù)據(jù)。確定實(shí)驗(yàn)對(duì)象的種類及數(shù)量：中藥藥理實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象包括正常動(dòng)物、麻醉動(dòng)物及病理模型；既有整體體內(nèi)試驗(yàn)，也有離體器官、組織或細(xì)胞體外試驗(yàn)等。盡量研究各種接近中醫(yī)臨床證候的動(dòng)物病理模型，按中醫(yī)藥治則，觀察中藥藥理與療效，但也不排除對(duì)正常動(dòng)物或離體器官等的作用分析。由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察畢竟有一定差別，因此考慮用不同動(dòng)物多種方法測試，往往是必要的。要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、方法的指?biāo)的要求決定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、樣本及數(shù)量、計(jì)量資料，一般小動(dòng)物（大、小鼠）每組8—12只，較大動(dòng)物（兔、狗）每組5—8只是基本的，總量應(yīng)符合統(tǒng)計(jì)要求。資料整理和統(tǒng)計(jì)：將紀(jì)錄的資料作為必要的分析、整理，經(jīng)過恰當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析，作出結(jié)論。 思考題：中藥藥理實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的三個(gè)原則是什么？舉例：1．目的：探討降脂膠囊調(diào)血脂作用的效應(yīng)。：采用高脂飼料喂養(yǎng)法復(fù)制大鼠（雄性大鼠）血脂異常模型(高脂飼料配方為：膽固醇2%,豬油10%，%，%,%)：將50只大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、降脂膠囊低劑量組（每千克體重14克）、高劑量組（每千