【文章內(nèi)容簡介】 位點或區(qū)域以及預(yù)測突變后的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能對蛋白質(zhì)工程是至關(guān)重要的。 ? 在明確突變位點或蛋白質(zhì)序列應(yīng)改變的區(qū)域后，可以進行定位突變，但要得到具有預(yù)期結(jié)構(gòu)與功能的蛋白質(zhì)是不容易的，可能需要經(jīng)過幾輪的循環(huán)。 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)知識的必要性 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)知識對于蛋白質(zhì)工程是絕對必要的。目前 PDB(Protein Data Bank)已收集數(shù)以萬計個蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)，但是通常蛋白質(zhì)序列的數(shù)目比蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的數(shù)目大 100倍。當我們開始對某一天然蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)分子設(shè)計時，首先要查找 PDB了解這個蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是否已被收錄。如果 PDB中沒有收錄又未見文獻報道，我們需要通過蛋白質(zhì) X射線晶體學(xué)及 NMR方法測定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，或者通過結(jié)構(gòu)預(yù)測的方法構(gòu)建該蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型。 功能數(shù)據(jù)庫 1. KEGG 京都基因和基因組百科全書 (KEGG)是系統(tǒng)分析基因功能，聯(lián)系基因組信息和功能信息的知識庫。 2. DIP 相互作用的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 (DIP)收集了由實驗驗證的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用。 3. ASDB 可變剪接數(shù)據(jù)庫 (ASDB)包括蛋白質(zhì)庫和核酸庫兩部分。ASDB的網(wǎng)址是： 4. TRRD 轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)數(shù)據(jù)庫 (TRRD)是在不斷積累的真核生物基因調(diào)控區(qū)結(jié)構(gòu)－功能特性信息基礎(chǔ)上構(gòu)建的。 5. TRANSFAC TRANSFAC數(shù)據(jù)庫是關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子、它們在基因組上的結(jié)合位點和與 DNA結(jié)合的 profiles的數(shù)據(jù)庫。 設(shè)計目標及解決辦法 ? 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系對于蛋白質(zhì)工程及蛋白質(zhì)分子設(shè)計都是至關(guān)重要的。如果我們想改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)，必須改變蛋白質(zhì)的序列。 ? Hartley等于 1986年完成了一個我們所要的有關(guān)蛋白質(zhì)重要性質(zhì)設(shè)計目標及解決辦法表，該表至今仍有參考價值。 設(shè)計目標 解決辦法 熱穩(wěn)定性 對氧化的穩(wěn)定性 對重金屬的穩(wěn)定性 pH穩(wěn)定性 提高酶學(xué)性質(zhì) 引入二硫橋 增加內(nèi)氫鍵數(shù)目 改善內(nèi)疏水堆積 增加表面鹽橋 把 Cys轉(zhuǎn)換為 Ala或 Ser 把 Met轉(zhuǎn)換為 Gln、 Val、 Ile或 Leu 把 Trp轉(zhuǎn)換為 Phe或 Tyr 把 Cys轉(zhuǎn)換為 Ala或 Ser 把 Met轉(zhuǎn)換為 Gln、 Val、 Ile或 Leu 替代表面羧基 替換表面荷電基團 His、 Cys以及 Tyr的置換 內(nèi)離子對的置換 專一性的改變 增加逆轉(zhuǎn)數(shù) (turnover number) 改變酸堿度 蛋白質(zhì)設(shè)計的目標及解決辦法 Tyr酪 Phe苯丙 Cys半胱氨酸 ser絲 , thr蘇 ala丙 , val纈 , leu亮 , ile異亮 , met蛋 (gly甘 ) asn天冬酰胺 , gln谷酰胺 asp天冬氨酸 , glu谷氨酸 tyr酪 , (trp色 , his組 ) 蛋白質(zhì)突變體的設(shè)計涉及如下 3個步驟。 （ 1）從天然蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)出發(fā) (實驗測定或預(yù)測 )，利用計算機模擬技術(shù)確定突變位點及替換的氨基酸。這是非常關(guān)鍵的步驟，一般應(yīng)注意如下問題。 a．應(yīng)確定對蛋白質(zhì)折疊敏感的區(qū)域，這些區(qū)域包括帶有特殊扭角的氨基酸、鹽橋、密堆積區(qū)等。 b．應(yīng)確定對功能非常重要的位置，這些可以從結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系、生物化學(xué)或蛋白質(zhì)工程實驗及結(jié)構(gòu)上的考慮。 c．應(yīng)該考察剩余位置對所希望改變的影響。 d．當進行互換或插入刪除殘基時應(yīng)考慮它們對結(jié)構(gòu)特征的影響，如疏水堆積、側(cè)鏈取向、氫鍵、鹽橋等。同時也要考慮它們對蛋白質(zhì)功能的影響?；Q或插入 /刪除區(qū)域一般都在外環(huán)。有如下一些假設(shè)：氨基酸側(cè)鏈的改變不會影響該主鏈折疊的改變，插入 /刪除某些部分不會影響表面區(qū)域，側(cè)鏈交換遵守蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)保守原則。 （ 2）利用能量優(yōu)化及蛋白質(zhì)動力學(xué)方法預(yù)測修飾后的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。 （ 3）預(yù)測的結(jié)構(gòu)與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較，利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 功能或結(jié)構(gòu) 穩(wěn)定性相關(guān)知識及理論計算預(yù)測新蛋白質(zhì)可能具有的性質(zhì)。 在上述設(shè)計工作完成后，要進行合成或突變實驗并經(jīng)分離、純化及表征后得到所要求的新的蛋白質(zhì)。 計算機蛋白質(zhì)設(shè)計只是有效實驗設(shè)計的一種方法。它不能替代實驗，正像蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測不能替代蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定一樣。如果一個科學(xué)家設(shè)計一種具有新的催化性質(zhì)的酶，他必須了解催化過程及機理；了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)化學(xué)、生物化學(xué)方面的知識。因此蛋白質(zhì)設(shè)計的成功與否，必須要有理論與實驗的緊密結(jié)合。 內(nèi)核假設(shè) 在蛋白質(zhì)內(nèi)部側(cè)鏈相互作用決定蛋白質(zhì)特殊折疊。一個非常簡單、有用的關(guān)于蛋白質(zhì)折疊的假設(shè)是，假定蛋白質(zhì)獨特的折疊形式主要由蛋白質(zhì)內(nèi)核中殘基的相互作用所決定。所謂內(nèi)核是指蛋白質(zhì)在進化中保守的內(nèi)部區(qū)域。在大多數(shù)情況，內(nèi)核由氫鍵連接的二級結(jié)構(gòu)單元組成。 二、蛋白質(zhì)設(shè)計原理 所有蛋白質(zhì)內(nèi)部都是密堆積 (很少有空穴大到可以結(jié)合一個水分子或惰性氣體 )，并且沒有重疊。 這個限制是由兩個因素造成的。第一個因素是分子是從內(nèi)部排出的，這是總疏水效應(yīng)的一部分；第二個因素是由原子間的倫敦色散力所引起的，是由于短吸引力的優(yōu)化。 所有內(nèi)部的氫鍵都是最大滿足的 (主鏈反側(cè)鏈 )。 蛋白質(zhì)的氫鍵形成涉及一個交換反應(yīng)，溶劑鍵被蛋白質(zhì)鍵所替代。隨著溶劑鍵的斷裂所帶來的能量損失是由折疊狀態(tài)的重組以及可能釋放一個結(jié)合的水分子而引起的熵的增益所彌補。 疏水及親水基團需要合理地分布在溶劑可及表面及不可及表面。 這種分布代表了疏水效應(yīng)的主要驅(qū)動力。這種分布的正確設(shè)計不是簡單地使暴露殘基親水、使埋藏殘基疏水。至少有兩種原因使圖像復(fù)雜化。首先，側(cè)鏈不總是完全地親水，例如賴氨酸有一個帶電的胺基，但是連接到主鏈上的碳原子是疏水的。因此在建模過程中要在原子水平上區(qū)分側(cè)鏈為疏水及親水部分。第二，正確的分布是更安排少許疏水基團在表面，少許親水基團在內(nèi)部。 在金屬蛋白中，配位殘基的替換要滿足金屬配位幾何。 這要求圍繞金屬中心放置合適數(shù)目的蛋白質(zhì)側(cè)鏈或溶劑分子，并符合正確的鍵長、鍵角以及整體的幾何。 對于金屬蛋白，圍繞金屬中心的第二殼層中的相互作用是重要的。 大部分配基合有多于一個與金屬作用或形成氫鍵的基團。如果一個功能基團與金屬結(jié)合，另幾個功能基團可以自由地采取其他的相互作用方式?？偨Y(jié)金屬蛋白的結(jié)構(gòu)表明，這些第二基團總是參與圍繞金屬中心的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。氫鍵的第二殼層通常涉及與蛋白質(zhì)主鏈的相互作用，有時也參與同側(cè)鏈或水分子的相互作用。 這些相互作用起到兩個作用。第一符合蛋白質(zhì)折疊的熱力學(xué)要求；第二這些氫鍵固定在空間的配位位置。 最優(yōu)的氨基酸側(cè)鏈幾何排列 蛋白質(zhì)中側(cè)鏈構(gòu)象是由空間兩個立體因素所決定。首先側(cè)鏈構(gòu)象是由旋轉(zhuǎn)每條鏈的立體勢壘所決定，其擇優(yōu)構(gòu)象可以通過實驗統(tǒng)計測量，也可以由第一原理計算得到。第二個因素是由氨基酸在結(jié)構(gòu)小的位置所決定。蛋白質(zhì)內(nèi)部的密堆積表明在折疊狀態(tài)側(cè)鏈構(gòu)象只能采取一種合適的構(gòu)象，即一種能量最低的構(gòu)象。 結(jié)構(gòu)及功能的專一性。形成獨特的結(jié)構(gòu)，獨特的分子間相互作用是生物相互作用及反應(yīng)的標志。實踐表明這是蛋白質(zhì)設(shè)計最困難的問題。 要構(gòu)筑一個蛋白質(zhì)模型必須滿足所有的合適的幾何要求，同時滿足蛋白質(zhì)折疊的幾何限制。因為蛋白質(zhì)是一個復(fù)雜的體系，體系有可能采取一個能量與所希望狀態(tài)相近的另外一個構(gòu)象。因此在設(shè)計程序中必須引入一個特征，它穩(wěn)定所希望的狀態(tài)，而不穩(wěn)定不希望的狀態(tài)，這也是最困難的計算機模擬技術(shù)之一。目前蛋白質(zhì)設(shè)計還是實驗性科學(xué)，它的成功需要幾個“設(shè)計循環(huán)”，即設(shè)計、構(gòu)筑、再設(shè)計等。情況愈復(fù)雜，循環(huán)次數(shù)就會眾多。雖然困難，但是仍然是有成果的。它可以在實踐中發(fā)現(xiàn)新的因素，產(chǎn)生新的概念并修正老的概念。 三、蛋白質(zhì)設(shè)計中的結(jié)構(gòu)－功能關(guān)系研究 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)－功能關(guān)系的重要性 蛋白質(zhì)的序列、三維結(jié)構(gòu)，熱力學(xué)及功能性質(zhì)之間的關(guān)系是目前廣泛關(guān)注的熱點。它對于蛋白質(zhì)工程及蛋白質(zhì)設(shè)計都是非常重要的。這方面的研究有助于基于 序列 和 三維結(jié)構(gòu)信息 預(yù)測 蛋白質(zhì)的功能 以及序列的改變?nèi)绾斡绊懙鞍踪|(zhì)的功能。這將增加設(shè)計具有預(yù)定結(jié)構(gòu)與功能的蛋白質(zhì)的能力。對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的認識過程始于蛋白質(zhì)中重要功能殘基及蛋白質(zhì)與其他分子相互作用的確定。 定位突變在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究中的作用 通過定位突變替換單獨的氨基酸殘基是分析功能殘基的有力工具。選擇突變殘基，最重要的信息來自結(jié)構(gòu)特征。因此如果蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)是未知的，則突變功能殘基的研究帶有不確定性。不能很好區(qū)別蛋