【正文】 末端基氨基酸測定 ① 肼解法 H 2 N C H CR OH N C H CR O OR nCC HH N O Hn 1N 端氨基酸 C 端氨基酸OR nCC HH 2 N O HH 2 N C H CR ON H N H 2 +H+N H 2 N H 2氨基酸酰肼 C 端氨基酸C端氨基酸的測定 ? 羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C端逐個的水解。 多肽鏈的選擇性降解 C H3S ：C H2C H2C HN H C N H C H CO OR+ B r C+NB rC H3S+C H2C H2C HN H C N H C H CO ORC NC H3S C N C H2C HN H C N H C H CO ORC H2+H2O+C H2C HN H COC H2O H3N+C H COR高絲氨酸內(nèi)酯? (4)測定每個肽段的氨基酸順序。 （ PMF） :是對蛋白質(zhì)酶解或降解后所得到的多肽混合物進行質(zhì)譜分析的方法，對質(zhì)譜分析所得肽端與多肽蛋白數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的理論肽段進行比較，從而判斷所測蛋白質(zhì)是已知還是未知。 蛋白質(zhì)工程與蛋白質(zhì)設(shè)計的術(shù)語是 20世紀 80年代初產(chǎn)生的。 計算機模擬 基因構(gòu)建 突變蛋白質(zhì)產(chǎn)品 功能分析 蛋白質(zhì)設(shè)計循環(huán) 蛋白質(zhì)分子設(shè)計大致涉及的幾個重要方面 ? 在蛋白質(zhì)設(shè)計開始之前，要對所要求的活性進行篩選。ASDB的網(wǎng)址是： 4. TRRD 轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)數(shù)據(jù)庫 (TRRD)是在不斷積累的真核生物基因調(diào)控區(qū)結(jié)構(gòu)－功能特性信息基礎(chǔ)上構(gòu)建的。 （ 3）預測的結(jié)構(gòu)與原始的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較，利用蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 功能或結(jié)構(gòu) 穩(wěn)定性相關(guān)知識及理論計算預測新蛋白質(zhì)可能具有的性質(zhì)。 疏水及親水基團需要合理地分布在溶劑可及表面及不可及表面。 最優(yōu)的氨基酸側(cè)鏈幾何排列 蛋白質(zhì)中側(cè)鏈構(gòu)象是由空間兩個立體因素所決定。這方面的研究有助于基于 序列 和 三維結(jié)構(gòu)信息 預測 蛋白質(zhì)的功能 以及序列的改變?nèi)绾斡绊懙鞍踪|(zhì)的功能。但是這些方法需要較大量的純的突變蛋白并要花較長時間，因此這些技術(shù)不能用于常規(guī)的大量突變體的分析。同源蛋白質(zhì)的保守的殘基是保持那類蛋白質(zhì)共同的功能或者是維持共同結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素。蛋白質(zhì)的功能是直接與它的三維結(jié)構(gòu)相關(guān)的，通過序列的改變來操縱結(jié)構(gòu)提供功能的多樣性。 分析己知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，可以認為復雜的三級折疊和四級結(jié)合可以分解為有數(shù)的二級結(jié)構(gòu)單元，例如螺旋、串、轉(zhuǎn)角，它們通過 LOOP連接為三級結(jié)構(gòu)。 4．在合成模板上肽的組裝 Mutter及其合作者發(fā)展了一種模板組裝合成蛋白 (TASPs)方法。 組合庫設(shè)計的一個核心問題是埋藏疏水部分。 ? 反向擬合的能力大于僅僅改變專一性的修飾。 5．膜蛋白及離子通道的設(shè)計 膜蛋白在許多生物過程中起重要作用。在產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)構(gòu)象集合 (庫 )和修飾蛋白質(zhì)主鏈時這些內(nèi)坐標項都是應該包括的。存在兩種靜電解劑化模型。 NCCN HNNOOC H 2 C H C H C H C H 2 O P O HO H O H O H OO HC H 3C H 3?缺乏時組織呼吸減弱，代謝強度降低。這些能雖可以直接用于蛋白質(zhì)內(nèi)核殘基，也可用于與蛋白質(zhì)折疊相聯(lián)系的溶劑暴露表面積相互作用的度量。能量的表達包括內(nèi)坐標項、范德華作用項、靜電相互作用項、氫鍵項、溶劑效應項及墑效應項等。 1979年他們報道了能與核酸相互作用的 34個殘基肽的設(shè)計、合成與表征。 蛋白質(zhì)的功能設(shè)計 １．通過反向擬合天然蛋白質(zhì)設(shè)計新的功能 ２．鍵合及催化的從頭設(shè)計 ３．在全新蛋白質(zhì)中引入結(jié)合位點 ４．催化活性蛋白質(zhì)的設(shè)計 ５．膜蛋白及離子通道的設(shè)計 ６．新材料的設(shè)計 1．通過反向擬合天然蛋白質(zhì)設(shè)計新的功能 執(zhí)行特別生物功能的天然蛋白質(zhì)能通過反向擬合獲得新的活性。比較庫中的全新蛋白質(zhì)與自然進化選擇的蛋白質(zhì)，可以得到很多有用的信息。 3．通過共價交叉連接實現(xiàn)肽的自組裝 設(shè)計全新蛋白的主要障礙是肽鏈的構(gòu)象熵。根據(jù)第一原理設(shè)計一個蛋白質(zhì)，我們必須依賴于分析已知結(jié)構(gòu)的天然蛋白質(zhì)中的二級結(jié)構(gòu)單元，例如螺旋、 β折疊片、 (環(huán) )以及轉(zhuǎn)折，得到一些結(jié)構(gòu)知識，這些知識涉及氨基酸形成二級結(jié)構(gòu)的傾向性等。 ? 這些結(jié)果說明不同的氨基序列具有相近的設(shè)計的結(jié)構(gòu)。 ? 往往非保守殘基或小的氨基酸殘基會被大的氨基酸所替代，這兩種突變都會引起蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化及引起功能的損失。 定位突變種類 ? 插入一個或多個氨基酸殘基； ? 刪除一個或多個氨基酸殘基； ? 替換或取代一個或多個氨基酸殘基。雖然困難，但是仍然是有成果的?？偨Y(jié)金屬蛋白的結(jié)構(gòu)表明，這些第二基團總是參與圍繞金屬中心的氫鍵網(wǎng)絡(luò)。第一個因素是分子是從內(nèi)部排出的，這是總疏水效應的一部分；第二個因素是由原子間的倫敦色散力所引起的，是由于短吸引力的優(yōu)化。同時也要考慮它們對蛋白質(zhì)功能的影響。如果 PDB中沒有收錄又未見文獻報道，我們需要通過蛋白質(zhì) X射線晶體學及 NMR方法測定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，或者通過結(jié)構(gòu)預測的方法構(gòu)建該蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型。 ? 蛋白質(zhì)設(shè)計是多學科的交叉領(lǐng)域。 其原因是與化學試劑比較，蛋白質(zhì)的分子量是非常大的，通常在 10000到 1000000之間．因此它們之中的大多數(shù)不能通過化學方法生產(chǎn)：在進化過程中蛋白質(zhì)的功能是在生理條件下發(fā)揮的，在其他條件、如在有機溶劑中它是不穩(wěn)定的。 ? 20世紀 80年代末，軟電離離子源 ESI（電噴霧電離）和 MALDI（基質(zhì)輔助激光解析電離）的出現(xiàn)，使質(zhì)譜技術(shù)成為了現(xiàn)代蛋白科學中最重要和不可缺少的研究手段。 R1=苯丙氨酸 Phe,色氨酸 Trp,酪氨酸 Tyr。 ? 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為 N末端的肽鍵速度最大?？稍?mol/L尿素或 6mol/L鹽酸胍存在下， 用過量的 ?巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑如碘乙酸保護生成的巰基，以防止它重新被氧化。食品生物技術(shù) 精品課程 ?主講：劉常金 第一章 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定 ? 蛋白質(zhì)氨基酸順序的測定是蛋白質(zhì)化學研究的基礎(chǔ)。 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定 ? (2)分析多肽鏈的 N末端和 C末端。 末端基氨基酸測定 ?氨肽酶法 ? 此法是多肽鏈 C端氨基酸分析法。 亮氨酸 Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度較快 。 ? 市場上出售的生物質(zhì)譜儀： ESIMS, MALDITOFMS等 生物質(zhì)譜在蛋白質(zhì)或多肽序列測定中的應用 分子量是蛋白質(zhì)、多肽最基本的物理參數(shù)。另外專一性很強是蛋白質(zhì)一大優(yōu)點，但從另一角度它的應用范圍卻受到影響，這又是它的缺點。 ? 蛋白質(zhì)設(shè)計在許多方面取得的顯著進展。 功能數(shù)據(jù)庫 1. KEGG 京都基因和基因組百科全書 (KEGG)是系統(tǒng)分析基因功能，聯(lián)系基因組信息和功能信息的知識庫。互換或插入 /刪除區(qū)域一般都在外環(huán)。 所有內(nèi)部的氫鍵都是最大滿足的 (主鏈反側(cè)鏈 )。氫鍵的第二殼層通常涉及與蛋白質(zhì)主鏈的相互作用，有時也參與同側(cè)鏈或水分子的相互作用。它可以在實踐中發(fā)現(xiàn)新的因素，產(chǎn)生新的概念并修正老的概念。 ? 最大量的定位突變是在體外利用重組 DNA技術(shù)或 PCR方法。在這些研究中，在每一個位置上的氨基酸由不同的幾個氨基酸所替換，可以比較蛋白質(zhì)保守及非保守替換對功能的影響。 第二節(jié) 全新蛋白質(zhì)設(shè)計 一、引言 特征 全新蛋白質(zhì)設(shè)計是另一類蛋白質(zhì)工程，合成具有特異結(jié)構(gòu)與功能的新蛋白質(zhì)。十多年來，科學家對螺旋已有很好的認識，近幾年的重點在于二級結(jié)構(gòu)在三維空間形成的獨特的構(gòu)象通過長程相互作用可控形成超二級結(jié)構(gòu)。當幾個沒有連接的肽鏈進行自組裝時，熵勢壘是比較難以克服的。 所有可能的氨基酸序列是一個天文數(shù)字，例如一個含有 100個殘基的序列可能有 20220種。修飾進化億萬年的蛋白質(zhì)，執(zhí)行我們自己選擇的功能是非常誘人的任務。 3．在全新蛋白質(zhì)中引入結(jié)合位點 全新蛋白質(zhì)設(shè)計除了能折疊為預想的結(jié)構(gòu)外，還要設(shè)計新的結(jié)合位點及催化性質(zhì)。項目的選擇是根據(jù)提高實驗與理論的相關(guān)性的要求進行的。一個溶劑化的非折疊蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換一個側(cè)鏈到一個折疊蛋白質(zhì)，部分或完全去溶劑位置所要求的能量，與從水到氣體或一個非極化溶劑是不同的。主要癥狀為口角炎、唇炎、舌炎、陰囊皮炎、眼瞼炎及角膜血管增生等