【正文】 C NC H3S C N C H2C HN H C N H C H CO ORC H2+H2O+C H2C HN H COC H2O H3N+C H COR高絲氨酸內(nèi)酯? (4)測定每個(gè)肽段的氨基酸順序。 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定 ? Edman （ 苯異硫氰酸酯法） 氨基酸順序分析法實(shí)際上也是一種 N端分析法。此法的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈 N端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。 Edman氨基酸順序分析法 N C S N H C H COR 2N C H COR 1HHNHS :CC H COR 1H N N H C H COR 2SNHCN H OCR 1C HN H 2 C H COR 2NCO C HN HSCR 12，一般測定步驟 (5)確定肽段在多肽鏈中的次序 。 利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定 2，一般測定步驟 (6)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置 。 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定 ? 一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈， ? 再利用對角線電泳技術(shù)分離出各個(gè)肽段，將每個(gè)肽段進(jìn)行組成及順序分析， ? 然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。 二硫鍵位置的確定 (7) 修飾氨基酸殘基的定位 : 用質(zhì)譜法 (ESI 或 MALDI)比較堿性磷酸酶去磷酸化前和后的肽段質(zhì)譜可以定位磷酸化位點(diǎn) 比較用糖苷酶水解前和后的肽段的質(zhì)譜 (基質(zhì)輔助的激光解析離子化 MALDI)可以定位糖基化位點(diǎn) 第二節(jié) 質(zhì)譜法測定肽鏈一級結(jié)構(gòu) ? 質(zhì)譜技術(shù)已有 100多年的歷史，但生物質(zhì)譜儀的誕生是近 20年的事情。 ? 生物質(zhì)譜儀的誕生為蛋白質(zhì)和多肽的結(jié)構(gòu)分析提供了重要的手段。 質(zhì)譜技術(shù)的基本原理 ? 質(zhì)譜（ Mass Spectrometry）是 帶電 原子、分子或分子碎片按質(zhì)核比（ m/z）的大小順序排列的圖譜。 ? 質(zhì)譜儀兩個(gè)核心部件：離子源、質(zhì)量分析器 ? 離子源的發(fā)展史也就是質(zhì)譜儀的發(fā)展史。 生物質(zhì)譜儀 ? 由于生物樣品極不穩(wěn)定，傳統(tǒng)離子源（ EI、CI）不能用來電離生物樣品。 ? 20世紀(jì) 80年代末，軟電離離子源 ESI（電噴霧電離）和 MALDI（基質(zhì)輔助激光解析電離）的出現(xiàn)，使質(zhì)譜技術(shù)成為了現(xiàn)代蛋白科學(xué)中最重要和不可缺少的研究手段。 ? 市場上出售的生物質(zhì)譜儀： ESIMS, MALDITOFMS等 生物質(zhì)譜在蛋白質(zhì)或多肽序列測定中的應(yīng)用 分子量是蛋白質(zhì)、多肽最基本的物理參數(shù)。分子量是基因工程產(chǎn)品報(bào)批的重要數(shù)據(jù)之一。 生物質(zhì)譜測定的蛋白質(zhì)分子量高達(dá) 40萬，精確度高達(dá) %%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前常規(guī)應(yīng)用的 SDSPAGE電泳與高效凝膠色譜技術(shù)等。 （ PMF） :是對蛋白質(zhì)酶解或降解后所得到的多肽混合物進(jìn)行質(zhì)譜分析的方法，對質(zhì)譜分析所得肽端與多肽蛋白數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的理論肽段進(jìn)行比較，從而判斷所測蛋白質(zhì)是已知還是未知。 肽譜是生物制藥企業(yè)鑒定生物技術(shù)藥物的常用手段。 、蛋白質(zhì)序列測定技術(shù) 隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，用 MS測定蛋白質(zhì)序列越來越被人們重視。 ? 串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可直接測定肽段的氨基酸序列，一級質(zhì)譜產(chǎn)生的肽段進(jìn)入二級質(zhì)譜，肽段沿肽健繼續(xù)斷裂，由所得到的肽段質(zhì)量數(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫查詢確定肽段序列，這就是肽序列標(biāo)簽技術(shù)（ PST）。 利用碘乙酰胺、 2硫蘇糖醇等試劑對蛋白質(zhì)進(jìn)行烷基化和還原烷基化，結(jié)合蛋白酶切、肽譜技術(shù)，利用生物質(zhì)譜的準(zhǔn)確分子量測定，可實(shí)現(xiàn)對二硫鍵和自由巰基的快速定位和確定。 蛋白質(zhì)翻譯后會(huì)根據(jù)不同功能要求發(fā)生 20多類修飾，其中最常見的是磷酸化和糖基化，這些修飾將極大影響其生物活性。 串聯(lián)質(zhì)譜的離子掃描模式可以快速選擇被修飾片段，然后根據(jù)特征丟失確定修飾類型，是目前最有效的對蛋白質(zhì)翻譯后修飾進(jìn)行識別和鑒定的分析手段。 ? 雙向電泳獲得大量蛋白質(zhì)點(diǎn)需要鑒定，只有質(zhì)譜技術(shù)才能滿足這樣的要求。 ? 質(zhì)譜技術(shù)是蛋白質(zhì)組研究的三大支撐技術(shù)（雙向電泳技術(shù)，質(zhì)譜技術(shù)，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫）之一。 ? 蛋白質(zhì)是一類非常有用的物質(zhì) 例如，酶是催化化學(xué)反應(yīng)的蛋白質(zhì)；抗體起到防護(hù)的作用；角蛋白或膠原蛋白用于穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；激素用于傳遞信號，作為電子傳遞及氧輸送的載體。從生態(tài)角度，蛋白質(zhì)也是非常理想的物質(zhì)，它的生物合成不需要消耗很多能量，它的專一性非常強(qiáng)、不會(huì)產(chǎn)生副作用并且能很快降解。 一、概述 ? 到目前為止蛋白質(zhì)沒有像化學(xué)試劑那樣被普遍應(yīng)用。 其原因是與化學(xué)試劑比較，蛋白質(zhì)的分子量是非常大的，通常在 10000到 1000000之間．因此它們之中的大多數(shù)不能通過化學(xué)方法生產(chǎn)：在進(jìn)化過程中蛋白質(zhì)的功能是在生理?xiàng)l件下發(fā)揮的，在其他條件、如在有機(jī)溶劑中它是不穩(wěn)定的。另外專一性很強(qiáng)是蛋白質(zhì)一大優(yōu)點(diǎn)，但從另一角度它的應(yīng)用范圍卻受到影響，這又是它的缺點(diǎn)。 分子生物學(xué)的迅速發(fā)展很快 克服了上述缺點(diǎn)或不足。 特別是定位突變及 PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) ) 使得蛋白質(zhì)可能工程化。 蛋白質(zhì)工程與蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的術(shù)語是 20世紀(jì) 80年代初產(chǎn)生的。通過序列修飾改造改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)并有應(yīng)用價(jià)值的第一個(gè)報(bào)道引起了人們廣泛的關(guān)注，紛紛成立了蛋白質(zhì)工程及設(shè)計(jì)的專門機(jī)構(gòu)。盡管通過蛋白質(zhì)工程研究已取得許多激動(dòng)人心的成果，但是通過蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)產(chǎn)生一個(gè)結(jié)構(gòu)確定、具有新的所希望性質(zhì)的穩(wěn)定的新蛋白質(zhì)并不容易。 公開性蛋白質(zhì) 的研究 組織 研究組織 目標(biāo) /特色 Protein Structure Initiative (美國 NIH) 十年內(nèi)定出一萬個(gè)蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu) Structural Diversity Pilot Project (美國 ) Rockefeller大學(xué)主導(dǎo)之學(xué)術(shù)合作 NMR Park Project(日本 ) 利用 NMR來決定老鼠蛋白質(zhì)之結(jié)構(gòu) Protein Structure Factory(德國 ) 醫(yī)學(xué)上重要蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之高速分析 Structural Biology Industrial Platform (歐洲 ) 包含幾個(gè)主要製藥公司等 16家公司所組成的聯(lián)盟 ? 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)的目的 一是為蛋白質(zhì)工程提供指導(dǎo)性信息；二是探索蛋白質(zhì)的折疊機(jī)理。蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)分為基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì)及全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)或蛋白質(zhì)從頭設(shè)計(jì)。簡單蛋白質(zhì)建筑或骨架的從頭設(shè)計(jì)是研究蛋白質(zhì)內(nèi)相互作用力的類型及本質(zhì)的很好途徑，也為解決蛋白質(zhì)折疊問題尋找定性和定量的規(guī)律。 ? 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)目前存在的問題 設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)與天然蛋白質(zhì)比較，缺乏結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性及明顯的功能優(yōu)越性。所有設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)有正確的形貌、顯著的二級結(jié)構(gòu)及合理的熱力學(xué)穩(wěn)定性，但一般說來它們的三級結(jié)構(gòu)的確定性較差。 從圖 21(a)看出，大然蛋白質(zhì)有確定主鏈結(jié)構(gòu)及側(cè)鏈構(gòu)象。圖 21(b)所示的設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)是一組低能構(gòu)象的集合，缺乏結(jié)構(gòu)獨(dú)特性。 ? 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)是一門新興的研究領(lǐng)域，其本身在不斷地發(fā)展，其內(nèi)容也在不斷地更新。 ? 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)及結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系研究的必要性。 ? 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)是多學(xué)科的交叉領(lǐng)域。 ? 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)在許多方面取得的顯著進(jìn)展。 第一節(jié) 基于天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分子設(shè)計(jì) 一、概述 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的認(rèn)識對蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)是至關(guān)重要的，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)涉及一級結(jié)構(gòu) (序列 )及三維結(jié)構(gòu)。即使蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)是已知的，選擇一個(gè)合適的突變體仍是困難的，這說明蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)任務(wù)的艱巨性，它涉及多種學(xué)科的配合，如計(jì)算機(jī)模擬專家、 X射線晶體學(xué)家、蛋白質(zhì)化學(xué)家、生物技術(shù)專家等的合作與配合。 計(jì)算機(jī)模擬 基因構(gòu)建 突變蛋白質(zhì)產(chǎn)品 功能分析 蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)循環(huán) 蛋白質(zhì)分子設(shè)計(jì)大致涉及的幾個(gè)重要方面 ? 在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)開始之前，要對所要求的活性進(jìn)行篩選。由于真菌與細(xì)胞相對容易處理，因此它們是一個(gè)生物活性物質(zhì)源。由于基因工程的發(fā)展，真核基因表達(dá)技術(shù)的發(fā)展使動(dòng)物蛋白質(zhì)與植物蛋白質(zhì)的數(shù)目迅速增長，又增加了新的生物活性物質(zhì)源。 ? 篩選以及純化蛋白質(zhì)需要進(jìn)行細(xì)致的表征，測定它們的序列、三維結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、催化活性等。 ? 專一性突變產(chǎn)物是蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)成敗的關(guān)鍵。一些新技術(shù)，如 PCR及自動(dòng)化技術(shù)的發(fā)展使各種類型的基因工程變得快速、容易。 ? 計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)循環(huán)中占有重要位置。建立蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型，確立突變