高中生物課件53血紅蛋白的提取和分離-文庫(kù)吧
2024-12-24 13:09 本頁(yè)面
【正文】 血紅蛋白的釋放 : 紅細(xì)胞在 蒸餾水 和 甲 苯 作用下破裂 , 釋放出血紅蛋白 退出 目錄 分離血紅蛋白溶液 : 混合液離心 → 過濾去除 脂溶性沉淀層 → 用分液漏斗分離 ( 2 ) 粗分離 : 透析 方法 : 將血紅蛋白溶液裝入 透析袋 中 , 將 透析袋 放入一定量適宜濃 度的 磷酸緩沖液 ( pH 為 7 . 0 ) 中 , 透析 12 h目的 : 除去 樣品中相對(duì)分子質(zhì)量較小 的雜質(zhì) 退出 目錄 ( 3 ) 純化 : 凝膠色譜 法。 ( 4 ) 純度鑒定 : SD S — 聚丙烯酰胺凝膠電泳 2. 凝膠色譜操作 ( 1 ) 凝膠色譜柱的制作 ( 2 ) 凝膠色譜柱的裝填 固定 : 將色譜柱 垂直 固定在支架上。 ↓ 裝填 : 將用蒸餾水充分溶脹后 的凝膠配成凝膠懸浮液 , 一次性 緩慢倒入色譜柱內(nèi) , 裝填時(shí)可輕輕敲動(dòng)色譜柱 , 使凝膠裝填 均勻 。 ↓ 洗脫 : 裝填完后 , 立即用緩沖液洗脫瓶 , 在約 5 0 c m 高的操作壓下 , 用3 0 0 m L 的物質(zhì)的量濃度為 2 0 m m o l/ L 的 磷酸緩沖液 ( pH 為 7 . 0 ) 充分洗滌平衡凝膠 1 2 h 。 退出 目錄 ( 3 ) 樣品的加入與洗脫 ① 加樣前 : 打開下端的流出口 , 使柱內(nèi)凝膠面上的 緩沖液 緩慢下降到與 凝膠面 平齊 , 關(guān)閉出口。 ② 加透析樣品 調(diào)整緩沖液面 : 與凝膠面平齊。 ↓ 滴加透析樣品 : 用吸管將 1 m L 透析后的樣品加到色譜柱的 頂端 。 ↓ 樣品滲入凝膠床 : 加樣后 , 打開 下端出口 , 等樣品完全進(jìn)入凝膠層后 ,關(guān)閉下端出口 。 退出 目錄 ↓ 洗脫 : 打開下端出口 , 用 2 0 m m o l/ L 的磷酸緩沖液 洗脫。 ↓ 收集 : 待 紅色的蛋白質(zhì) 接近色譜柱底端時(shí) , 用試管收集流出液 , 每 5 mL 收集一管 , 連續(xù)收集。 3. 操作提示 ( 1 ) 紅細(xì)胞的洗滌 : 洗滌次數(shù) 、 離心速度 與 離心時(shí)間 十分重要。 洗滌次數(shù) 過少 , 無法除去血漿蛋白 。 離心速度 過高和 時(shí)間 過長(zhǎng)會(huì)使 白細(xì)胞 等一同沉淀 , 達(dá)不到分離效果。 退出 目錄 ( 2 ) 色譜柱填料的處理 : 商品凝膠使用前需直接放在 洗脫液 中膨脹 ,可以將加入其中的 濕凝膠 用 沸水浴 加熱 , 加速膨脹。 ( 3 ) 凝膠色譜柱的裝填 : 在裝填 凝膠柱時(shí) , 不得有 氣泡 存在。氣泡會(huì)攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的 洗脫次序 , 降低 分離效果 。 ( 4 ) 蛋白質(zhì)的分離 : 如果紅色區(qū)帶 均勻一致 地移動(dòng) , 說明色譜柱制作成功。 退出 目錄 預(yù)習(xí)交流 2 —— 凝膠色譜柱和固定化酶的反應(yīng)柱有何區(qū)別 ? ( 1 ) 凝膠色譜柱和固定化酶的反應(yīng)柱都裝填有不能通過 “ 柱 ” 下端多孔板 ( 或多孔篩板 ) 的顆粒 ,它們的顆粒功能有何不同 ? 提示 :凝膠色譜柱裝填的是凝膠顆粒 ,允許小分子進(jìn)入 ,不允許大分子進(jìn)入 ,通過延長(zhǎng)小分子的路程使大分子與小分子
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