【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 rodis 線蟲(chóng)等 多種昆蟲(chóng) 蚊類幼蟲(chóng) 鞘翅目等 白毒蛾 等 棉蚜 等 褐蟻、桃蚜 等 舞毒蛾、蝽 等 鱗翅目 螨、線蟲(chóng)等 黑蟻 等 大青葉蟬 等 膜翅目等 蚜蟲(chóng)、星天牛 等 同翅目 鞘翅目 星天牛 等 二點(diǎn)豆園蝽 等 瓢蟲(chóng)等 大灰象甲 等 粉虱等 西 南 大 學(xué) 本 科 畢 業(yè) 論 文 5 昆蟲(chóng)病原真菌殺蟲(chóng)劑的特點(diǎn) 寄主范圍廣 在縱多蟲(chóng)生真菌中，雖然能夠 用于害蟲(chóng)防治的還不多，目前廣泛用于害蟲(chóng)防治的白僵菌能夠侵染 鱗翅目、同翅目、膜翅目、直翅目等 200多種昆蟲(chóng)和螨類 [24]。 侵染條件簡(jiǎn)單 昆蟲(chóng)病原真菌 是從病死昆蟲(chóng)上分離得到，病死的昆蟲(chóng)主要從農(nóng)田及其他自然生態(tài)環(huán)境中獲得，而分離得到的病原真菌對(duì)該害蟲(chóng)發(fā)生的環(huán)境有較好的適應(yīng)性，在相同或相似的環(huán)境條件下能夠成功侵染該害蟲(chóng)，使該蟲(chóng)致死，達(dá)到防治的效果。 昆蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗性 病原真菌的侵染機(jī)制不同于傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥，涉及多種酶的協(xié)同作用 [25]，而且真菌侵染昆蟲(chóng)后能夠分泌多種毒素，通過(guò)吸收蟲(chóng) 體營(yíng)養(yǎng)成分、妨礙血液循環(huán)、積累代謝產(chǎn)物等方式，導(dǎo)致昆蟲(chóng)新城代謝紊亂致死，其致死的因素是以生物作用為主 ,因此不易使害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性。 傳播范圍廣 許多昆蟲(chóng)病原真菌能夠產(chǎn)生易于擴(kuò)散的孢子，這些孢子可以通過(guò)風(fēng)、雨水 、種子和種苗 以及人事活動(dòng)等方式傳播 [26]，在合適的時(shí)候和環(huán)境條件下到達(dá)寄主（昆蟲(chóng)）表面并萌發(fā)，引起昆蟲(chóng)病害，而 且 這些病原真菌殺蟲(chóng)劑一旦施用后，可以在自然界中長(zhǎng)期保持一定數(shù)量的病原，對(duì)害蟲(chóng)起到持續(xù)控制的作用，降低防治成本。 具較高的安全性 白僵菌依靠自身分泌幾丁 質(zhì) 酶溶解昆蟲(chóng) 表皮的幾丁質(zhì)進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)進(jìn)行侵染 ,人體不含幾丁質(zhì) ,因此不侵染人畜 ,對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害 [14]。 西 南 大 學(xué) 本 科 畢 業(yè) 論 文 6 昆蟲(chóng)病原真菌殺蟲(chóng)機(jī)理 昆蟲(chóng)病原真菌 的 侵入機(jī)制 昆蟲(chóng)病原真菌的入侵是機(jī)械壓力和酶共同作用的結(jié)果。在侵入過(guò)程中，病原真菌選擇營(yíng)養(yǎng)豐富的蟲(chóng)體并分泌酶消解昆蟲(chóng)表皮，菌絲則穿過(guò)表皮達(dá)到侵入的目的， 也可以通過(guò)消化道 、 氣管和傷口侵入 ， 多數(shù)真菌以分生孢子作為侵染源 [8]。研究表明。病原真菌在入侵過(guò)程中主要分泌的有蛋白質(zhì)酶、幾丁質(zhì)酶、脂酶和酯酶等，幾種酶并不是獨(dú)立起作用的，而是相互作用形成一個(gè)復(fù)雜的酶系 [25]。 昆蟲(chóng)病原 真 菌的毒殺機(jī)理 昆蟲(chóng)病原 真 菌侵入蟲(chóng)體后，主要通過(guò)消耗寄主營(yíng)養(yǎng)、分泌真菌毒素，從而引起昆蟲(chóng)代謝紊亂，達(dá)到殺死昆蟲(chóng)的目的 [27,8]。 真菌以孢子附著在昆蟲(chóng)體壁上 ， 萌發(fā)產(chǎn)生芽管 ， 并分泌一些降解蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)的酶類物質(zhì) ， 從芽管頂端的附著胞長(zhǎng)出侵染絲穿透昆蟲(chóng)體表進(jìn)入血腔 ， 在血腔中斷裂為菌絲段 ， 菌絲段以芽殖方式大量繁殖同時(shí)吸取昆蟲(chóng)體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)致使昆蟲(chóng)死亡 。 研究還發(fā)現(xiàn) ， 真菌在侵入后還產(chǎn)生一些毒素 ， 這些毒素在昆蟲(chóng)致死過(guò)程中也起著極為重要的作用。 昆蟲(chóng)病原真菌的毒力 毒力是衡量菌株 生物防治潛力的重要指標(biāo) ,也是篩選優(yōu)良菌株的基本依據(jù)。它受寄主種類、菌種來(lái)源、孢子劑量、溫度等多種因素影響 [28]。研究表明，菌株來(lái)源對(duì)同種昆蟲(chóng)毒力差異往往較大， 同一菌株對(duì)不同寄主或同一寄主不同蟲(chóng)齡的毒力也有所不同，同時(shí)真菌的產(chǎn)酶活性與毒力也有一定關(guān)系 [22]。 問(wèn)題與展望 存在的問(wèn)題 目前 ， 真菌 殺蟲(chóng)劑 雖得到了較全面的開(kāi)發(fā)和廣泛應(yīng)用，但還存在一些突出的問(wèn)題和困難，阻礙了真菌 殺蟲(chóng) 劑的發(fā)展 ， 真菌殺蟲(chóng)劑大多是活體制劑 ， 由于目前生產(chǎn)能力有限 ， 加之活體制劑不能隨意添加防腐成分 ， 因此在生產(chǎn)、使用和保存西 南 大 學(xué) 本 科 畢 業(yè) 論 文 7 上 一定程度地限制了真菌殺蟲(chóng)劑的推廣。相對(duì)高的價(jià)格使得市場(chǎng)并未充分打開(kāi)。真菌源活性物質(zhì)往往因其品種和生長(zhǎng)階段而異。有些真菌不易繁殖、產(chǎn)孢量低、孢子活力差、加工成制劑后穩(wěn)定性差，或多代繁殖后致病力下降。 同時(shí)， 多數(shù)種類?；圆粡?qiáng) ， 寄主譜較廣，有可能傷害到天敵和其他有益昆蟲(chóng) [16]。已記載的蟲(chóng)生真菌與存在的蟲(chóng)生真菌資源相比還很少。多年來(lái) ， 人們所注意的蟲(chóng)生真菌主要是集中于常見(jiàn)的、能自然感染昆蟲(chóng)的真菌上。事實(shí)上 ， 在自然界還有很多未經(jīng)系統(tǒng)利用的殺蟲(chóng)真菌 ， 系統(tǒng)的資源調(diào)查收集還很有限 ， 從事資源方面的人很少 [22]。 展望 儲(chǔ)備有 應(yīng)用 潛力的候選 昆蟲(chóng)病原真菌 為提高 害蟲(chóng) 生防應(yīng)用程度，尋求更多的具有 害蟲(chóng) 生防潛力的真菌資源，需要大力開(kāi)展主要 害蟲(chóng) 的病原真菌調(diào)查，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用我國(guó)土著的 昆蟲(chóng) 病原真菌資源，針對(duì)我國(guó)的主要 蟲(chóng) 害開(kāi)展調(diào)查和評(píng)估。在評(píng)價(jià)目標(biāo) 害蟲(chóng) 的經(jīng)濟(jì)重要性和 昆蟲(chóng) 病原菌的可利用性基礎(chǔ)上，從中篩選極具潛力的研究對(duì)象發(fā)展真菌 殺蟲(chóng) 劑，盡可能在少投入、短時(shí)間內(nèi)獲得大量成果， 加強(qiáng)隊(duì)伍建設(shè) ,組織較大規(guī)模的資源系統(tǒng)調(diào)查和收集， 加強(qiáng)這一資源的開(kāi)發(fā)利用將為我國(guó)真菌 殺蟲(chóng) 劑的研制與應(yīng)用開(kāi)辟新前景。 加強(qiáng) 昆蟲(chóng)流行 病的系統(tǒng)研究 研究建立病原 —— 昆蟲(chóng)復(fù)合體定量生態(tài)因子模型并納入 有害生物綜合治理（ IPM） 中加以利用。流行病本身在時(shí)空上是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)體系。通過(guò)系統(tǒng)分析的方法 ,分析掌握害蟲(chóng)病害流行規(guī)律， 從整體觀點(diǎn)出發(fā) ,對(duì)系統(tǒng)中的各成分、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析和綜合 ,提出文字的、圖表的以及計(jì)算機(jī)的模型 ,通過(guò)反復(fù)測(cè)驗(yàn)、檢驗(yàn) ,使結(jié)構(gòu)和功能達(dá)到最優(yōu)化 ,為預(yù)測(cè)害蟲(chóng)流行病和綜合治理害蟲(chóng)服務(wù) [22]。 加強(qiáng)發(fā)酵技術(shù)及制劑加工的研究 真菌制劑已從生產(chǎn)試驗(yàn)走向規(guī)范化與商品化。世界上已陸續(xù)登記的有 8種殺蟲(chóng)真菌 26種商品 ,分屬于 12個(gè)國(guó)家 (王成樹(shù) , 1996)[16]。 工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵技術(shù)及西 南 大 學(xué) 本 科 畢 業(yè) 論 文 8 適合的劑型是影響 真菌殺蟲(chóng) 劑大量生產(chǎn)和商品化的主要因素之一。造成有些高效、安全的真菌 殺蟲(chóng) 劑不易繁殖、產(chǎn)孢量低、活力差或多代繁殖后致病力下降等問(wèn)題。目前中科院首創(chuàng)的壓力脈動(dòng)固態(tài)發(fā)酵技術(shù)為低成本工業(yè)化生產(chǎn)提供了可能，另外，適當(dāng)?shù)闹鷦╊愋图爸苿┘庸ぜ夹g(shù)對(duì)真菌 殺蟲(chóng) 劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用亦很重要，科學(xué)合理的制劑不僅能促進(jìn)和調(diào)節(jié)致病力而且可以減少對(duì)環(huán)境的依賴性，提高防治效果和穩(wěn)定性。 與 害蟲(chóng) 綜合治理策略和遺傳工程相結(jié)合 害蟲(chóng) 生物防治是持續(xù)農(nóng)業(yè)的一個(gè)重要組成 部分，因此真菌 殺蟲(chóng) 劑在實(shí)用中應(yīng)注重與各種 蟲(chóng)害 防除措施的綜合及協(xié)調(diào)。真菌 殺蟲(chóng) 劑與其它防治措施尤其是化學(xué)殺蟲(chóng) 劑的配合使用，對(duì)其實(shí)際應(yīng)用有重要推動(dòng)作用。配合適量適宜組合的化學(xué) 殺蟲(chóng) 劑不僅能充分發(fā)揮真菌 殺蟲(chóng) 劑的防效，而且可以彌補(bǔ)化學(xué) 殺蟲(chóng) 劑在對(duì)付抗性 害蟲(chóng) 上的不足，降低化學(xué) 殺蟲(chóng) 劑給環(huán)境帶來(lái)的污染，降低使用成本、擴(kuò)大防治譜、增加真菌 殺蟲(chóng) 劑的應(yīng)用潛力。近年來(lái)飛速發(fā)展的重組技術(shù)已逐漸引入到生物 殺蟲(chóng)劑的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，可通過(guò)操縱產(chǎn)生毒素的基因，或改良潛在的具 有殺蟲(chóng) 作用的特殊酶基因來(lái)提高真菌 殺蟲(chóng) 劑的致病力及防治效果。 西 南 大 學(xué) 本 科 畢 業(yè) 論 文 9 2 引 言 馬鈴薯甲蟲(chóng) （ Leptinotarsa decemlineata Say） 屬鞘翅目葉甲科， 又稱馬鈴薯葉甲或科羅拉多馬鈴薯甲蟲(chóng) ,首次在 Colorado報(bào)道 [29]，是重要的外來(lái)入侵物種和檢疫性害蟲(chóng) [30]，該蟲(chóng) 1年發(fā)生 2個(gè)完整世代及 1個(gè)不完整的第 3代 ， 世代重疊現(xiàn)象嚴(yán)重，馬鈴薯甲蟲(chóng)以成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)咬食馬鈴薯 、 茄子等茄科蔬菜（如圖 2） 。 在干燥的氣候環(huán)境下 ， 大量暴食蔬菜葉片 ， 嚴(yán)重發(fā)生時(shí)可在 23 d 將蔬菜葉片咬食殆盡 ，造成蔬菜嚴(yán)重減產(chǎn) ， 甚至絕收 [31]。 原分布于美洲、前蘇聯(lián)及一些歐美國(guó)家， 1993年傳入我國(guó)新疆伊犁地區(qū) [32]，現(xiàn)已擴(kuò)散到新疆天山以北的大部分地區(qū)，發(fā)生面積達(dá) km2，其危害呈快速上升趨勢(shì)，造成重要的經(jīng)濟(jì)損失 [33]。它具有傳播途徑廣、繁殖能力強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)、寄主作物多等特點(diǎn) [33,35]?，F(xiàn)有的防治中主要采用化學(xué)防治，農(nóng)業(yè)、物理防治和生物防治相結(jié)合的防治方法，其防控關(guān)鍵是加強(qiáng)疫情監(jiān)測(cè)，做好預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)工作以及采用綜合防治等手段 [34]。在目前的害蟲(chóng)防治方法發(fā)展階段，對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)的防治以化學(xué)防治為主，但馬鈴薯甲蟲(chóng)很容易產(chǎn)生抗藥性，其抗藥性產(chǎn)生 主要與體內(nèi)代謝酶系活性升高有關(guān) [33]。隨著科技水平和人們環(huán)保意識(shí)的不斷提高，馬鈴薯甲蟲(chóng)的防治主要注重生物防治，國(guó)外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)二點(diǎn)益蝽等有控制作用的天敵昆蟲(chóng)種類以及開(kāi)發(fā)出多殺菌素等防治馬鈴薯甲蟲(chóng)的生物殺蟲(chóng)劑 [3638]。 圖 1：馬鈴薯甲蟲(chóng)的危害 Figure 1. Damage caused by Colorado Potato Beetle 注 : ； ； 外來(lái)入侵昆蟲(chóng)的生物控制是一種安全有效的控害技術(shù)。 在入侵 物種 病死蟲(chóng)體上 尋找一種自然生物控制因子 （病原菌） 是國(guó)際上普遍使用的 昆蟲(chóng)生防菌研究策西 南 大 學(xué) 本 科 畢 業(yè) 論 文 10 略。馬鈴薯甲蟲(chóng)已傳入我國(guó)的新疆地區(qū)，因此從疫區(qū)采集病死馬鈴薯甲蟲(chóng)蟲(chóng)體，采用常規(guī)昆蟲(chóng)真菌分離方法獲得病原真菌，再進(jìn)行致病性測(cè)定，獲得對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)有較好的致死效果的生防菌，以進(jìn)一步進(jìn)行生物農(nóng)藥的開(kāi)發(fā) 。 中國(guó)目前 對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)有較好致病能力病原菌的報(bào)道還很少 ， 對(duì)馬鈴薯甲蟲(chóng)病原真菌的研究都處于探索階段，還未見(jiàn)有生物防治方面應(yīng)用的報(bào)道。 近年來(lái)利用微生物防治 害蟲(chóng) 等有害生物的成就為生物防治 馬鈴薯甲蟲(chóng) 提供了一條有效途徑，且微生物 殺蟲(chóng)劑 具有對(duì)靶標(biāo)生 物安全、對(duì)環(huán)境無(wú)污染、安全性高的特點(diǎn)。因此尋找 馬鈴薯甲蟲(chóng) 病原菌、篩選其生防菌成為亟待解決的問(wèn)題。 我國(guó)擁有豐富的蟲(chóng)生真菌資源，也是進(jìn)行生物防治最早的國(guó)家 [10]， 在馬鈴薯甲蟲(chóng)生物 防治的研究和應(yīng)用 方面 具有較大的優(yōu)勢(shì)和前景 。 西 南 大 學(xué) 本 科 畢 業(yè) 論 文 11 3 材料與方法 供試材料 馬鈴薯甲蟲(chóng)病蟲(chóng)標(biāo)本：從新疆伊犁、阿爾泰和喀什等地采集感病致死的馬鈴薯甲蟲(chóng)成蟲(chóng)標(biāo)本。 培養(yǎng)基：真菌分離時(shí)采用 SDAY 培養(yǎng)基：葡萄糖 20g、蛋白胨 5g、酵母粉5g、瓊脂 10g、磷酸二氫鉀 、硫酸鎂 、蒸餾水 500ml,充分溶解， 121℃滅菌 25min。 供試家蠶：致病性實(shí)驗(yàn)采用家蠶 (Bombyx mori)的二齡幼蟲(chóng)，由西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院家蠶研究室提供。每天從西南大學(xué)農(nóng)場(chǎng)桑園采集新鮮桑葉飼養(yǎng)。 實(shí)驗(yàn)方法 菌株分離與活化 在感病馬鈴薯甲蟲(chóng)蟲(chóng)體上挑取一小塊組織置于 SDAY 培養(yǎng)基平板上，當(dāng)長(zhǎng)出典型菌落時(shí)從其邊緣挑取適當(dāng)大小的菌絲塊移到新的培養(yǎng)基平板上在 25℃下培養(yǎng)，然后由不同菌落進(jìn)行涂布法單孢分離純化。將純化的菌株編號(hào)，轉(zhuǎn)到 SDAY斜面培養(yǎng)基上， 4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩? 在使用菌株接種前，在無(wú)菌環(huán)境下 從保存在 SDAY 斜面培養(yǎng)基上挑取一小塊菌絲塊移到新的 SDAY 培養(yǎng)基平板上，封口后置于恒溫培養(yǎng)箱 （ RH:100%, 25℃ ） 中活化菌株，培養(yǎng)產(chǎn)孢后用于接種試驗(yàn)。 蠶體接種試驗(yàn) 選擇年齡結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)狀況一致且健康的幼蟲(chóng)用于試驗(yàn)。選用的試蟲(chóng)放于墊有一層吸水紙的直徑為 15cm 的培養(yǎng)皿中，在室溫下飼養(yǎng)。 用活化的菌落，刮取一定量的孢子，加入到滅菌水中，充分振蕩均勻，并作適當(dāng)稀釋制成孢子懸浮液，其濃度約為 1089個(gè)孢子 /mL。 將試蟲(chóng)置于直徑 15cm 的滅菌培養(yǎng)皿（培養(yǎng)皿內(nèi)墊有一層吸水紙，每皿 50西 南 大 學(xué) 本 科 畢 業(yè) 論 文 12 頭） 中，用移液槍吸取已配置好的孢子懸浮液均勻噴灑在蠶體壁周圍，以充分接觸為宜。待蟲(chóng)體壁較干，吸水紙較干時(shí)，添加一定的干凈桑葉，然后蓋上紗布，置于室溫中，讓其生長(zhǎng)。另外以滅菌清水噴灑蠶體作對(duì)照。每個(gè)菌株處理和對(duì)照都設(shè)置 3個(gè)重復(fù)。 觀察記錄和數(shù)據(jù)處理 接種處理后，每天定時(shí)定量添加新鮮桑葉并定時(shí)觀察記錄 家蠶 的發(fā)病情況。用 軟件和 Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。