【文章內容簡介】 生成亞氨基碳酸酯衍生物，然后再與酶分子上的氨基偶聯(lián)，制成固定化酶。 任何具有連位羥基的高聚物都可用溴化氰法來活化。 烷基化和芳基化法 以鹵素為功能團的載體可與酶蛋白分子上的氨基、巰基、酚基等發(fā)生烷基化或芳基化反應而使酶固定化。 此法常用的載體有鹵乙酰、三嗪基或鹵異丁烯基的衍生物。 對于無機載體，可用直接法和涂層法（用活化物的聚合物如白蛋白或葡聚糖涂層）。 共價結合法的優(yōu)缺點 優(yōu)點：共價鍵的鍵能高，酶和載體之間的結合相當牢固，即使用高濃度底物溶液或鹽溶液，也不會使酶分子從載體上脫落下來，具有酶穩(wěn)定性好、可連續(xù)使用較長時間的優(yōu)點。 缺點：載體活化的難度較大，操作復雜，反應條件較劇烈，制備過程中酶直接參與化學反應，易引起酶蛋白空間構象變化。 各種固定化方法的比較 吸附法 物理吸附法 離子吸附法 包埋法 共價鍵結合法 交聯(lián)法 制備 易 易 較難 難 較難 結合程度 弱 中等 強 強 強 活力回收率 高，但酶易流失 高 高 低 中等 再生 可能 可能 不可能 不可能 不可能 固定化成本 低 低 低 高 中等 底物專一性 不變 不變 不變 可變 可變 二 輔酶和輔基的固定化 輔酶固定化原因 1）輔酶因子中特殊化學基團參與催化反應； 2）輔酶因子流失，且不能再生； 3）輔酶因子價格昂貴； —— 工業(yè)上應用全酶的關鍵是有機輔因子的保留和再生。 輔酶固定化的方法： 1. 固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等共價偶聯(lián)，或將其進行適當?shù)幕瘜W修飾后固定在超濾器中。 2. 輔酶固定化必須解決輔酶在多個酶之間傳遞的障礙。 需要輔酶的酶反應體系： 1 輔酶與酶均不固定化； 2 輔酶不固定而酶固定； 3 輔酶固定而酶不固定； 4 輔酶和酶分別固定； 5 輔酶和酶共固定； 6 輔酶與酶分子偶聯(lián)形成輔酶 酶復合物的反應系統(tǒng) （輔酶分子量小，難以截留） 反應的擴散阻力大 輔酶固定化的形式： 三 固定化細胞的制備 ⒈ 固定化細胞的定義 將細胞限制或定位于特定空間位置的方法稱為細胞固定化技術。 固定化細胞就是被限制自由移動的細胞，即細胞受到物理化學因素的約束或限制在一定的空間界限內，但細胞仍保留催化活性并具有能被反復或連續(xù)使用的活力。 ⒉ 固定化細胞的特點 有細胞特性，生物催化劑功能，固相催化劑特點。 優(yōu)點： ① 無須進行酶的分離純化 ② 保持酶的原始狀態(tài)，酶回收率高 ③ 比固定化酶穩(wěn)定性高 ④ 細胞內酶輔助因子可再生 ⑤ 細胞本身含多酶體系 ⑥ 抗污染能力強 3 固定化細胞生理學特性 如上圖所示： 第一類一般只適用于一種酶催化的反應。 第二類由一種輔酶或少數(shù)幾種酶催化的反應。 第三類適用與多酶反應，特別是需要輔酶的反應。 4 固定化細胞的制備技術 理想的固定化細胞的制備方法，應該具有如下特點： 。 2. 方法簡單、易行，應盡可能少損傷細胞。 。 胞。 ⑴ 載體結合法 是將細胞懸液直接與水不溶性的載體 相結合的固定化方法。 涉及到酶或細胞的化學修飾，可能引起細胞破壞，應盡量在溫和的條件下進行反應。 由于在使用中細胞間、細胞和載體之間的鍵不容易被破壞，所以操作的穩(wěn)定性高。 ⑵ 包埋法 將細胞定位于凝膠網(wǎng)格內的技術。 實際使用中限制酶活力的因素較多，且只適合于小分子底物。 適合用于固定活細胞。 ⑶ 交聯(lián)法 用多功能試劑對細胞進行交聯(lián)的固 定化方法。 沒有良好的機械強度，不合適實際使用，細胞濃度較高。 ⑷ 無載體法 靠細胞自身的絮凝作用制備固定化細胞的技術。 ⑸ 選擇性熱變性法 專用于細胞固定化。是將細胞在適當?shù)臏囟认绿幚硎辜毎さ鞍鬃冃裕皇姑缸冃远姑腹潭ㄓ诩毎麅鹊姆椒ā? 5 固定化活細胞 將活細胞限制或定位于特定空間位置的方法。 無需進行酶的分離和純化，減少酶的活力損失，同時大大降低了成本； 保持了酶的原始狀態(tài)，比固定化酶的穩(wěn)定性更高，對污染的抵抗力更強； 細胞本身含多酶系統(tǒng)，可催化一系列反應，且不需添加輔助因子； 細胞生長停滯時間短，細胞多，反應快等。 固定化活細胞的優(yōu)越性 缺點 ? 必須保持菌體的完整，需防止菌體的自溶，否則影響產(chǎn)物的純度； ? 必須抑制細胞內蛋白酶對目的酶的分解； ? 胞內多酶的存在，會形成副產(chǎn)物； ? 載體、細胞膜或細胞壁會造成底物滲透與擴散的障礙等。 制備方法 固定化完整細胞的方法很多，但是沒有一種理想的通用方法；對于特定的應用，必須找到價格低廉、簡便的方法，高活力保留和操作穩(wěn)定性是評價固定化生物催化劑的先決條件。 四、固定化酶的形狀與性質 ⒈ 固定化酶的形狀 固定化酶的形式多樣，依不同用途有顆粒狀、纖維狀、酶膜和酶管等形狀。 其中顆粒占絕大多數(shù)，它和纖維狀主要用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，如裝成酶柱用于連續(xù)生產(chǎn)，或在反應器中進行批式攪拌反應。 ⒉ 固定化酶的性質 ⑴ 酶活力的變化 固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力低，其原因可能是： – 酶活性中心的重要氨基酸殘基被載體結合； – 高級結構和空間構象的改變； – 空間位阻的影響； – 內擴散阻力； – 半透膜的隔離。 個別情況下，酶經(jīng)固定化后其活力升高。 ⑵ 酶穩(wěn)定性的變化 操作穩(wěn)定性：體內半衰期 貯藏穩(wěn)定性：低溫放置 熱穩(wěn)定性：耐熱性提高 對蛋白酶的穩(wěn)定性：空間位阻 其他：對有機溶劑、 pH、酶抑制劑等的穩(wěn)定性均有提高。 ⑶ 酶學特性的變化 底物特異性：對高分子底物的活性明顯下降； 最適 pH：最適 pH和 pH曲線常會發(fā)生偏移； 最適溫度：多數(shù)較游離酶高； 動力學常數(shù)： Km均增大，增大幅度視情況而定； 最大反應速度：與游離酶大多數(shù)是相同或相近。 五 評價固定化酶生物催化劑的指標 1 固定化酶 (細胞）的活力 定義： 固定化酶細胞催化策一特定化學反應的能力，其大小可用在一定條件下它所催化的某一反應的反應的速度來表示。 固定化酶（細胞）的單位可定義為每毫克干重固定化酶（細胞）每分鐘轉化底物（或生產(chǎn)產(chǎn)物）的量。