【文章內(nèi)容簡介】 生成亞氨基碳酸酯衍生物，然后再與酶分子上的氨基偶聯(lián)，制成固定化酶。 任何具有連位羥基的高聚物都可用溴化氰法來活化。 烷基化和芳基化法 以鹵素為功能團(tuán)的載體可與酶蛋白分子上的氨基、巰基、酚基等發(fā)生烷基化或芳基化反應(yīng)而使酶固定化。 此法常用的載體有鹵乙酰、三嗪基或鹵異丁烯基的衍生物。 對于無機(jī)載體，可用直接法和涂層法（用活化物的聚合物如白蛋白或葡聚糖涂層）。 共價(jià)結(jié)合法的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：共價(jià)鍵的鍵能高，酶和載體之間的結(jié)合相當(dāng)牢固，即使用高濃度底物溶液或鹽溶液，也不會使酶分子從載體上脫落下來，具有酶穩(wěn)定性好、可連續(xù)使用較長時(shí)間的優(yōu)點(diǎn)。 缺點(diǎn)：載體活化的難度較大，操作復(fù)雜，反應(yīng)條件較劇烈，制備過程中酶直接參與化學(xué)反應(yīng)，易引起酶蛋白空間構(gòu)象變化。 各種固定化方法的比較 吸附法 物理吸附法 離子吸附法 包埋法 共價(jià)鍵結(jié)合法 交聯(lián)法 制備 易 易 較難 難 較難 結(jié)合程度 弱 中等 強(qiáng) 強(qiáng) 強(qiáng) 活力回收率 高，但酶易流失 高 高 低 中等 再生 可能 可能 不可能 不可能 不可能 固定化成本 低 低 低 高 中等 底物專一性 不變 不變 不變 可變 可變 二 輔酶和輔基的固定化 輔酶固定化原因 1）輔酶因子中特殊化學(xué)基團(tuán)參與催化反應(yīng)； 2）輔酶因子流失，且不能再生； 3）輔酶因子價(jià)格昂貴； —— 工業(yè)上應(yīng)用全酶的關(guān)鍵是有機(jī)輔因子的保留和再生。 輔酶固定化的方法： 1. 固定化方法與酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯(lián)法等共價(jià)偶聯(lián)，或?qū)⑵溥M(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾后固定在超濾器中。 2. 輔酶固定化必須解決輔酶在多個(gè)酶之間傳遞的障礙。 需要輔酶的酶反應(yīng)體系： 1 輔酶與酶均不固定化； 2 輔酶不固定而酶固定； 3 輔酶固定而酶不固定； 4 輔酶和酶分別固定； 5 輔酶和酶共固定； 6 輔酶與酶分子偶聯(lián)形成輔酶 酶復(fù)合物的反應(yīng)系統(tǒng) （輔酶分子量小，難以截留） 反應(yīng)的擴(kuò)散阻力大 輔酶固定化的形式： 三 固定化細(xì)胞的制備 ⒈ 固定化細(xì)胞的定義 將細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法稱為細(xì)胞固定化技術(shù)。 固定化細(xì)胞就是被限制自由移動(dòng)的細(xì)胞，即細(xì)胞受到物理化學(xué)因素的約束或限制在一定的空間界限內(nèi)，但細(xì)胞仍保留催化活性并具有能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力。 ⒉ 固定化細(xì)胞的特點(diǎn) 有細(xì)胞特性，生物催化劑功能，固相催化劑特點(diǎn)。 優(yōu)點(diǎn)： ① 無須進(jìn)行酶的分離純化 ② 保持酶的原始狀態(tài)，酶回收率高 ③ 比固定化酶穩(wěn)定性高 ④ 細(xì)胞內(nèi)酶輔助因子可再生 ⑤ 細(xì)胞本身含多酶體系 ⑥ 抗污染能力強(qiáng) 3 固定化細(xì)胞生理學(xué)特性 如上圖所示： 第一類一般只適用于一種酶催化的反應(yīng)。 第二類由一種輔酶或少數(shù)幾種酶催化的反應(yīng)。 第三類適用與多酶反應(yīng)，特別是需要輔酶的反應(yīng)。 4 固定化細(xì)胞的制備技術(shù) 理想的固定化細(xì)胞的制備方法，應(yīng)該具有如下特點(diǎn)： 。 2. 方法簡單、易行，應(yīng)盡可能少損傷細(xì)胞。 。 胞。 ⑴ 載體結(jié)合法 是將細(xì)胞懸液直接與水不溶性的載體 相結(jié)合的固定化方法。 涉及到酶或細(xì)胞的化學(xué)修飾，可能引起細(xì)胞破壞，應(yīng)盡量在溫和的條件下進(jìn)行反應(yīng)。 由于在使用中細(xì)胞間、細(xì)胞和載體之間的鍵不容易被破壞，所以操作的穩(wěn)定性高。 ⑵ 包埋法 將細(xì)胞定位于凝膠網(wǎng)格內(nèi)的技術(shù)。 實(shí)際使用中限制酶活力的因素較多，且只適合于小分子底物。 適合用于固定活細(xì)胞。 ⑶ 交聯(lián)法 用多功能試劑對細(xì)胞進(jìn)行交聯(lián)的固 定化方法。 沒有良好的機(jī)械強(qiáng)度，不合適實(shí)際使用，細(xì)胞濃度較高。 ⑷ 無載體法 靠細(xì)胞自身的絮凝作用制備固定化細(xì)胞的技術(shù)。 ⑸ 選擇性熱變性法 專用于細(xì)胞固定化。是將細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臏囟认绿幚硎辜?xì)胞膜蛋白變性，但不使酶變性而使酶固定于細(xì)胞內(nèi)的方法。 5 固定化活細(xì)胞 將活細(xì)胞限制或定位于特定空間位置的方法。 無需進(jìn)行酶的分離和純化，減少酶的活力損失，同時(shí)大大降低了成本； 保持了酶的原始狀態(tài)，比固定化酶的穩(wěn)定性更高，對污染的抵抗力更強(qiáng)； 細(xì)胞本身含多酶系統(tǒng)，可催化一系列反應(yīng)，且不需添加輔助因子； 細(xì)胞生長停滯時(shí)間短，細(xì)胞多，反應(yīng)快等。 固定化活細(xì)胞的優(yōu)越性 缺點(diǎn) ? 必須保持菌體的完整，需防止菌體的自溶，否則影響產(chǎn)物的純度； ? 必須抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對目的酶的分解； ? 胞內(nèi)多酶的存在，會形成副產(chǎn)物； ? 載體、細(xì)胞膜或細(xì)胞壁會造成底物滲透與擴(kuò)散的障礙等。 制備方法 固定化完整細(xì)胞的方法很多，但是沒有一種理想的通用方法；對于特定的應(yīng)用，必須找到價(jià)格低廉、簡便的方法，高活力保留和操作穩(wěn)定性是評價(jià)固定化生物催化劑的先決條件。 四、固定化酶的形狀與性質(zhì) ⒈ 固定化酶的形狀 固定化酶的形式多樣，依不同用途有顆粒狀、纖維狀、酶膜和酶管等形狀。 其中顆粒占絕大多數(shù)，它和纖維狀主要用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，如裝成酶柱用于連續(xù)生產(chǎn)，或在反應(yīng)器中進(jìn)行批式攪拌反應(yīng)。 ⒉ 固定化酶的性質(zhì) ⑴ 酶活力的變化 固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶的活力低，其原因可能是： – 酶活性中心的重要氨基酸殘基被載體結(jié)合； – 高級結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的改變； – 空間位阻的影響； – 內(nèi)擴(kuò)散阻力； – 半透膜的隔離。 個(gè)別情況下，酶經(jīng)固定化后其活力升高。 ⑵ 酶穩(wěn)定性的變化 操作穩(wěn)定性：體內(nèi)半衰期 貯藏穩(wěn)定性：低溫放置 熱穩(wěn)定性：耐熱性提高 對蛋白酶的穩(wěn)定性：空間位阻 其他：對有機(jī)溶劑、 pH、酶抑制劑等的穩(wěn)定性均有提高。 ⑶ 酶學(xué)特性的變化 底物特異性：對高分子底物的活性明顯下降； 最適 pH：最適 pH和 pH曲線常會發(fā)生偏移； 最適溫度：多數(shù)較游離酶高； 動(dòng)力學(xué)常數(shù)： Km均增大，增大幅度視情況而定； 最大反應(yīng)速度：與游離酶大多數(shù)是相同或相近。 五 評價(jià)固定化酶生物催化劑的指標(biāo) 1 固定化酶 (細(xì)胞）的活力 定義： 固定化酶細(xì)胞催化策一特定化學(xué)反應(yīng)的能力，其大小可用在一定條件下它所催化的某一反應(yīng)的反應(yīng)的速度來表示。 固定化酶（細(xì)胞）的單位可定義為每毫克干重固定化酶（細(xì)胞）每分鐘轉(zhuǎn)化底物（或生產(chǎn)產(chǎn)物）的量。